Inhaltsverzeichnis

Cover

Titel

Impressum

Widmung

Vorwort zur zweiten Auflage

Vorwort zur ersten Auflage

Abkürzungen

1 Einführung in die Mikrobiologie

1.1 Historisches
1.2 Bedeutung
1.3 Mikroorganismengruppen
1.4 Die Bakterienzelle
1.5 Taxonomie der Mikroorganismen
1.6 Medizinische Mikrobiologie

2 Rahmenbedingungen für den Betrieb mikrobiologischer Laboratorien

2.1 Gesetze und technische Regelwerke
2.2 Medizinische Betreuung der Mitarbeiter
2.3 Betriebsbeschreibung für mikrobiologische Laboratorien
2.4 Einrichtung mikrobiologischer Laboratorien
2.5 Nährmedien
2.6 Rezepturen

3 Kalibrierung und Qualifizierung der Geräte

3.1 Waage
3.2 pH-Meter
3.3 Kolbenhubpipetten
3.4 Stoppuhr
3.5 Geräte zur Erreichung bestimmter Temperaturen
3.6 Clean Bench
3.7 Air Sampler
3.8 Partikelzähler
3.9 Messgerät zur Bestimmung der Wasseraktivität
3.10 Fotometer/Reader
3.11 Tube Reader für Endotoxinbestimmungen
3.12 Fluoreszenzreader für Endotoxinbestimmungen

4 Stammhaltung

4.1 Bezug
4.2 Versand
4.3 Lagerung
4.4 Kultivierung

5 Betriebshygiene

5.1 Hygiene
5.2 Mikrobiologische Grundlagen zur Hygiene
5.3 Hygienemaßnahmen
5.4 Sterilisation, Desinfektion und aseptische Herstellung
5.5 Hygieneplan für mikrobiologische Laboratorien
5.6 Schädlingsbekämpfung (Pest Control)
5.7 Hygienebeauftragte
5.8 Durchführung von Hygieneschulungen

6 Umgebungsmonitoring

6.1 Methoden
6.2 Mikrobiologisches Monitoring im Sterilitätstest-Isolator
6.3 Physikalisches Monitoring in der Sterilproduktion
6.4 Physikalischer Betrieb
6.5 Auswertung der Mikroorganismen
6.6 Register der Mikroorganismen

7 Qualitätskontrolle

7.1 Arzneibuchmethoden (Compendial Methods)
7.2 Nichtarzneibuchmethoden (Non-compendial Methods)
7.3 Tests unter Verwendung von Tiermodellen
7.4 Zellkulturmethoden
7.5 Validierung der Arzneibuchmethoden

8 Prozessvalidierungen

8.1 Nährmedienabfüllung (Media Fill)
8.2 Entpyrogenisierung
8.3 Validierung der Sterilisation mit trockener Hitze
8.4 Validierung der Sterilisation mittels feuchter Hitze (Autoklav)
8.5 Validierung der Sterilfiltration
8.6 Container-Closure-Integrity-Test
8.7 Reinigungsvalidierung

9 Mikrobiologische Untersuchung von Wasser

9.1 Probennahme
9.2 Probentransport
9.3 Verwendung der verschiedenen Wasserqualitäten
9.4 Gereinigtes Wasser (Aqua purificata, AP)
9.5 Hochgereinigtes Wasser (HPW)
9.6 Wasser für Injektionszwecke (WfI)
9.7 Wasser zum Verdünnen konzentrierter Hämodialyselösungen
9.8 Wasser zur Herstellung von Extrakten
9.9 Trinkwasser
9.10 Legionellen

10 Mikrobiologische Schnellmethoden (Rapid Microbiological Methods)

10.1 Bestimmung über den ATP-Gehalt
10.2 Bestimmung über den Einbau von Fluoreszenzmarkern
10.3 Durchflusszytometrie

11 Automation im mikrobiologischen Labor

11.1 Färbeautomaten
11.2 Geräte zur Zählung der Kolonien (KBE)
11.3 Nährmedienabfüllautomat
11.4 Automation des Endotoxintests

12 Qualitätssicherung

12.1 Aufbau eines SOP-Systems
12.2 Schulungen
12.3 Audits und Inspektionen
12.4 Vorgehensweise bei OOS- und OOE-Ergebnissen

13 Identifizierung von Mikroorganismen

13.1 Wachstumskurve
13.2 Generationszeit
13.3 Herstellung von Reinkulturen
13.4 Sensorische und makroskopische Merkmale
13.5 Mikroskopische Untersuchung
13.6 Färbungen
13.7 Prinzip der „bunten Reihe“
13.8 Immunologische Verfahren
13.9 PCR
13.10 Gaschromatografie (FAME)
13.11 FT-IR-Spektroskopie
13.12 MALDI-TOF

14 Reinigung, Sterilisation, Dekontamination und Entsorgung

14.1 Reinigung
14.2 Sterilisation
14.3 Laborreinigung und -desinfektion
14.4 Entsorgung infektiösen Abfalls
14.5 Desinfektionsmaßnahmen bei Havarien

15 Prüfungen im Lohnauftrag (Outsourcing)

Mikrobiologische Netzwerke

Adressen

Fachliteratur

Glossar

Stichwortverzeichnis

Endbenutzer-Lizenzvereinbarung

List of Tables

1 Einführung in die Mikrobiologie

Tab. 1.1 Gruppen von Mikroorganismen und biologischen Agenzien.
Tab. 1.2 Größenordnungen von Partikeln und von Zellen.
Tab. 1.3 Lebensbereich für Schimmelpilze. Im mit X gekennzeichneten Bereich ist das Wachstum der Schimmelpilze optimal.
Tab. 1.4 Minimum-Wasseraktivitätswerte (a_w) für das Wachstum verschiedener Mikroorganismen. Unterhalb von 0,60 ist kein Wachstum mehr möglich. Zusammenstellung aus [18–21].
Tab. 1.5 Umgebungsbedingungen für Mikroorganismen.
Tab. 1.6 Humanpathogene Escherichia coli-Stämme.
Tab. 1.7 Infektionskrankheiten und ihre Übertragungswege, Erreger (auslösendes Agenz) und Infektionsdosen.
Tab. 1.8 Einige Erkrankungen des Menschen und die wahrscheinlichen tierischen Infektionsquellen [9, 32, 33].

2 Rahmenbedingungen für den Betrieb mikrobiologischer Laboratorien

Tab. 2.1 MOPS-Puffer (4-Morpholinpropansulfonsäure-Puffer) zur Kultivierung von Escherichia coli. MOPS puffert gut im pH-Wertbereich von 6,5–7,9.
Tab. 2.2 Verschiedene Größen von Petrischalen und ihre Verwendungszwecke.

3 Kalibrierung und Qualifizierung der Geräte

Tab. 3.1 Nennvolumen und Fehlergrenzen bei Kolbenhubpipetten nach DIN EN ISO 8655 Teil 2 [10].
Tab. 3.2 Definierte Temperaturbereiche nach Ph. Eur. und USP.
Tab. 3.3 Im Mikrobiologielabor häufig benötigte Temperaturbereiche.
Tab. 3.4 Korrekturtabelle für den Impaktionssammler MAS 100 NT^®, der im Sammelkopf eine Siebplatte mit N = 300 Löchern, Lochdurchmesser 0,6 mm, enthält [14].
Tab. 3.5 Zusammenstellung von Luftkeimsammelgeräten (Air Sampler) mit Angaben zum Hersteller/Vertreiber, Möglichkeit der isokinetischen Messung, Kalibrierung und einzusetzende Medien. Die Tabelle erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit.
Tab. 3.6 Kalibrierlösungen nach USP XL (2017), Kapitel 〈1112〉[8].
Tab. 3.7 Empfehlenswerte Kalibrierfrequenzen.

4 Stammhaltung

Tab. 4.1 Zusammenstellung der in der Europäischen Pharmakopöe publizierten Mikroorganismen (nicht vollständig). Eingruppierung in die Risikogruppen nach [1, 2].
Tab. 4.2 Lagerungszeiten verschiedener Mikroorganismen in Abhängigkeit von den angewandten Aufbewahrungstechniken.

5 Betriebshygiene

Tab. 5.1 Mikrobielle Besiedlung des gesunden und des erkrankten Menschen. Zusammengestellt nach [9–13]. Die Bestimmung der Normalflora des Kots geht auf Untersuchungen der NASA zurück.
Tab. 5.2 Reinraumklassen gemäß Annex 1 des EU-Leitfadens der Guten Herstellungspraxis und in Übereinstimmung mit EN ISO 14644-1, Werte „at rest“.
Tab. 5.3 Reinraumklassen gemäß Annex 1 des EU-Leitfadens der Guten Herstellungspraxis und in Übereinstimmung mit EN ISO 14644-1, Werte „in operation“.
Tab. 5.4 Monitoring und Grenzwerte in den kritischen Bereichen A bis F.
Tab. 5.5 Monitoringfrequenzen in den kritischen Bereichen A bis F.
Tab. 5.6 Abgabe von Partikeln (Hautschuppen) pro Minute durch verschiedene Tätigkeiten und Bewegungen des Menschen [14].
Tab. 5.7 Vergleich von Reinigungs-, Desinfektions- und Sterilisationswirkungen.
Tab. 5.8 Einsatzbereiche und Methoden zur Desinfektion.
Tab. 5.9 Beispiele für Reinigungs- und Desinfektionsmittel für verschiedene Anwendungen.
Tab. 5.10 Wirkstoffe zur Desinfektion unbehüllter und behüllter Viren [18].
Tab. 5.11 Desinfektionsplan für die Mikrobiologischen Laboratorien (Beispiel).
Tab. 5.12 Toxizität der verschiedenen Insektizide für Mensch und Tier [21].
Tab. 5.13 Typische Hygieneschädlinge und Krankheitsüberträger in Mitteleuropa.

6 Umgebungsmonitoring

Tab. 6.1 Gegenüberstellung Reinraum (Teilbarriere) und Isolator (Absolutbarriere).
Tab. 6.2 Gasförmige Sterilisation bzw. Dekontamination.
Tab. 6.3 Ergebnisse der Handschuhprüfungen (Druckprüfung und visuell).
Tab. 6.4 Arbeitstägliches Monitoring der Luft und der Oberflächen im Isolator.
Tab. 6.5 Richt- und Alarmwerte der physikalischen Parameter.
Tab. 6.6 Einschätzung der Kritikalität von Alarmen und Reaktionen darauf.
Tab. 6.7 Reinraumklassifikation nach ISO EN DIN 14644-1:2015 [9]. Angegeben sind die Partikelzahlen pro Kubikmeter.
Tab. 6.8 Anzahl der Messpunkte aus DIN EN ISO 14644-1, 2015 [9].
Tab. 6.9 Auflistung von Luftwechselraten (technische Empfehlung), Überdruck und Erholzeiten, Filtertyp für die Versorgungs- und Umluft in den vier Reinraumklassen.
Tab. 6.10 Mikrobiologisches Umgebungsmonitoring im physikalischen Betrieb.
Tab. 6.11 Auswertung der Befunde über ein Jahr.
Tab. 6.12 Auswertung des Personalmonitorings aus einem Quartal.
Tab. 6.13 Neue Nomenklatur für Pseudomonaden und nah verwandte Mikroorganismen [20].

7 Qualitätskontrolle

Tab. 7.1 Vor- und Nachteile der Endotoxinbestimmungsmethoden aus Ph. Eur., Kapitel 2.6.14.
Tab. 7.2 Verschiedene Endotoxinformulierungen.
Tab. 7.3 Verdünnungstabelle.
Tab. 7.4 Verdünnungstabelle.
Tab. 7.5 Beispiel 1. Geometrischer Mittelwert = 0,24 IU/ml. Aus der Doppelbestimmung ist die letzte positive Verdünnungsstufe 1 : 8, die Verdünnung 1 : 16 ist negativ.
Tab. 7.6 Beispiel 2. Geometrischer Mittelwert = 0,17 IU/ml. Aus der Doppelbestimmung 1 : 4 sind beide Werte positiv, aus der Doppelbestimmung 1 : 8 ist ein Wert positiv und ein Wert negativ, beide Werte aus der Verdünnung 1 : 16 sind negativ.
Tab. 7.7 Im LAL-Test geprüfte Substanzen. Die MVD ist für das augenblicklich eingesetzte Lysat mit einer Empfindlichkeit von 0,03 EU/ml angegeben.
Tab. 7.8 Resultate von 3 In-vitro-Pyrogen-Tests mit frischem Humanblut (endotoxin equivalent unit, EEU). Inkubation vor der Messung 20 h bei 36–38 °C.
Tab. 7.9 Pyrogentest von Vitamin D₃. Akzeptanzkriterium nach Ph. Eur.: Die Summe darf nicht größer 1,15 °C sein.
Tab. 7.10 Ultrafiltration der Vitaminlösung, Dauer 30 min; Methode: Gel-Clot-Test.
Tab. 7.11 Test mit verschiedenen Endotoxin-Spike-Konzentrationen in der Vitaminlösung; Methode: Gel-Clot-Test.
Tab. 7.12 Test mit verschiedenen Endotoxin-Spike-Konzentrationen in der Vitaminlösung; Methode: MAT (IPT-Kit der Fa. Charles River).
Tab. 7.13 Reagenzien zum Demasking (Bestandteile des Demasking-Kit Endo-RS^® der Fa. Hyglos, Bernried).
Tab. 7.14 Testorganismen der Ph. Eur., USP und DIN EN ISO.
Tab. 7.15 Anforderungen der Konservierung an Parenteralia und Ophthalmika.
Tab. 7.16 Anforderungen der Konservierung an Topika.
Tab. 7.17 Anforderungen an Oralia. Die Kriterien stellen die empfohlene Wirksamkeit dar.
Tab. 7.18 Zusammenfassende Tabelle für Sterilprodukte, Ophthalmika, Topika.
Tab. 7.19 Beispiel 1 für einen Konservierungsmittelbelastungstest mit den Testergebnissen. Die bakterizide Wirkung von 0,08 % Silbernitrat (oligodynamischer Effekt) wird aufgezeigt.
Tab. 7.20 Beispiel 2 für einen Konservierungsmittelbelastungstest mit den Testergebnissen. Die bakterizide Wirkung von BAC (300 μg/ml) und EDTA (500 μg/ml) in einem Nasalium wird aufgezeigt. Die Kombination von BAC mit EDTA ist sehr effektiv.
Tab. 7.21 Eigenschaften ausgewählter Mykoplasmen, nach [24].
Tab. 7.22 Die wichtigsten human- und tierpathogenen Mykobakterienarten und ihre Hauptwirte, nach [28].
Tab. 7.23 Zusammenstellung mit den von der Ph. Eur., Kapitel 5.1.2 vorgegebenen Bioindikatoren, ergänzt um den sporoziden Dekontaminationsprozess mit VHP™.
Tab. 7.24 Für Vitaminbestimmungen eingesetzte Testorganismen.
Tab. 7.25 Zusammenfassung der Ergebnisse der Untersuchungen an Celluloseprefiltern.
Tab. 7.26 Mikrobiologische Aktionsgrenzen für Primärpackmittel für Arzneimittel.
Tab. 7.27 Gemessene Zellgrößen in WfI und CSB nach ansteigenden Inkubationszeiten.
Tab. 7.28 Bakteriologische Spezifikationen für die eingesetzten Reinigungs- und Desinfektionsmittel.
Tab. 7.29 Prozentuale Verteilung der Labortiere in Deutschland im Jahre 2009 [46]. Die Summe der Tiere beträgt ungefähr 2,8 Millionen.
Tab. 7.30 Zusammenstellung von Daten über die wichtigsten Versuchstiere, nach [49] und ergänzt um [47].
Tab. 7.31 Antibiotika zur Verwendung in der Zellkultur, aus [51], verändert.
Tab. 7.32 Testmikroorganismen (angegeben sind nur die ATCC-Nummern) und Inkubationsbedingungen.
Tab. 7.33 Visuelle Wachstumsprüfung der inokulierten Testorganismen in den Filtrationseinheiten nach Produktfiltration und Überschichtung mit Nährmedium.
Tab. 7.34 Neutralisierende Maßnahmen und Agenzien.
Tab. 7.35 Testkeime und Inkubationsbedingungen zur Validierung von TAMC und TYMC.
Tab. 7.36 Nachweis spezifizierter Mikroorganismen.
Tab. 7.37 Probenvorbereitung zum Nachweis der spezifizierten Mikroorganismen.
Tab. 7.38 Auswertung des quantitativen Nachweises von galletoleranten, gramnegativen Bakterien in 1 g bzw. 1 ml.
Tab. 7.39 Beispielhaft dargestellte Ergebnisse nach Prüfung auf Hemmung (inhibition) und Verstärkung (enhancement), λ = 0,03 IU. Der Test auf Hemmung und Verstärkung ist bestanden, wenn alle vier 2λ Spikes positiv und die 0,25λ Spikes negativ sind.
Tab. 7.40 Schwellen- und Maximaldosis bei unterschiedlichen Applikationswegen.

8 Prozessvalidierungen

Tab. 8.1 Formaler Ablauf der Prozessvalidierung.
Tab. 8.2 Bakterienkonzentrationen entsprechend MacFarland-Standard (nach bioMerieux).
Tab. 8.3 Anzahl der maximal erlaubten kontaminierten Behältnisse [k] bei [U] abgefüllten Behältnissen.
Tab. 8.4 Warn- und Aktionslevels für große Zahlen abgefüllter Media-fill-Einheiten gemäß JP XV, 2006.
Tab. 8.5 Entpyrogenisierung im Heißluftsterilisator (250 °C, 120 min) bei definierter Maximalbeladung. Vials 1–5 wurden auf dem oberen Ablageboden platziert, Vials 6–10 auf dem unteren Boden. Methode: kinetischchromogener Test, vier Positivkontrollen mit Endotoxin aus Escherichia coli O113:H10, geometrischer Mittelwert = 2467 EU/ml, arithmetischer Mittelwert = 2477 EU/ml, Standardabweichung = 300. Bezugsgröße für die Abreicherung ist der geometrische Mittelwert.
Tab. 8.6 Ergebnisse der Durchläufe von zehn endotoxindotierten, parallel angeordneten 10 ml-Glasampullen durch den Entpyrogenisierungstunnel (Breite 40 cm, Temperatur 290 °C, 9600 Ampullen/h). Methode: kinetischturbidimetrischer Test. Positivkontrolle mit n = 4 Ampullen, geometrischer Mittelwert 1089 EU/Ampulle.
Tab. 8.7 Beladungsschemata bei zwei Sterilisatoren. Die Pipettendose enthält Glaspipetten, der Drahtkorb Mahlköpfe aus Metall (für Mühlen, die zum Zerkleinern von Tabletten benötigt werden), die Metallboxen enthalten Kleinteile aus Metall wie Spatel und Scheren.
Tab. 8.8 Abtötezeiten bei den Temperaturen 100 °C, 105 °C und 121 °C [10].
Tab. 8.9 Ergebnisse der visuellen Prüfung von 300 analysierten Primärbehältern nach der mikrobiologischen Integritätsprüfung.
Tab. 8.10 Bestimmung der Anzahl vermehrungsfähiger Pseudomonas aeruginosa-Zellen aus der Tauchsuspension während der Integritätsprüfung.
Tab. 8.11 Wachstumsprüfung von inokuliertem Medium nach der mikrobiologischen Integritätsprüfung.
Tab. 8.12 Ergebnisse (Mittelwerte der Doppelbestimmung) der Endotoxin-Swabs, kinetisch-turbidimetrischer LAL-Test.

9 Mikrobiologische Untersuchung von Wasser

Tab. 9.1 Im Wasser häufig gefundene Mikroorganismen.
Tab. 9.2 Krankheitserreger, die über das Wasser auf den Menschen übertragen werden können.
Tab. 9.3 Krankheitsausbrüche, verursacht durch kontaminiertes Wasser (Auswahl).
Tab. 9.4 Desinfektionsmittel zur Eliminierung der Mikroorganismen in Biofilmen.
Tab. 9.5 In Biofilmen vertretene Mikroorganismen, nach [7] verändert. 1 = sporadisch, 2 = gelegentlich, 3 = häufig, 4 = sehr häufig, 5 = stets.
Tab. 9.6 Einsatz der verschiedenen Wasserqualitäten.
Tab. 9.7 Nährstoffgehalt der Agarmedien CSA und R2A (beide gemäß Ph. Eur.), Plate Count Agar (PCA) und R2A/R3A.
Tab. 9.8 Aktions-, Warn- und Toleranzlimits für die verschiedenen Wasserqualitäten.
Tab. 9.9 TVO gibt im § 5 Anlage 1 die erlaubten mikrobiologischen Parameter und im § 7 Anlage 3 die Indikatorparameter vor.
Tab. 9.10 Härtebereiche von Trinkwasser.
Tab. 9.11 Typische Verunreinigungen im Trinkwasser [14].

10 Mikrobiologische Schnellmethoden (Rapid Microbiological Methods)

Tab. 10.1 Zusammenfassende Tabelle über mikrobiologische Schnellmethoden.
Tab. 10.2 Pseudomonas aeruginosa, kultiviert in CSB. Bestimmung der Trübung, der Koloniezahl, der Endotoxine (Lysatempfindlichkeit 0,03 EU/ml) und der RLU mit dem Standard Sensitivity Kit.

12 Qualitätssicherung

Tab. 12.1 Gesundheitsbehörden verschiedener Länder weltweit.
Tab. 12.2 Landesgesundheitsbehörden in Deutschland, oberste Landesgesundheitsbehörde im Fettdruck [4].
Tab. 12.3 Auswertung der Prüfung auf Pyrogene nach Ph. Eur., Tab. 2.6.8.1.

13 Identifizierung von Mikroorganismen

Tab. 13.1 Vergleich von Licht- und Elektronenmikroskop.
Tab. 13.2 Gramnegative und grampositive Bakterien und ihre Zellform.
Tab. 13.3 Vorhandensein der verschiedenen Fettsäuretypen in verschiedenen Bakteriengruppen.
Tab. 13.4 Wellenzahlen der durch FT-IR-Spektroskopie nachweisbaren Moleküle.

14 Reinigung, Sterilisation, Dekontamination und Entsorgung

Tab. 14.1 Inaktivierungstemperaturen und -zeiten, bezogen auf feuchte Hitze, Zusammenstellung aus der Literatur [1, 3].

List of Illustrations

1 Einführung in die Mikrobiologie

Abb. 1.1 Weiße Schimmelpilze auf feuchtem Möbelholz im Keller, nach einem Eindringen von Regenwasser.
Abb. 1.2 Aspergillus niger auf Agarplatte, REM-Aufnahme. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde (HZI), Braunschweig.
Abb. 1.3 Sporenfärbung bei Bacillus cereus. Die Sporen sind grün, die vegetativen Zellen rot gefärbt. Vergrößerung 1000×, Immersionsöl. Mit freundlicher Genehmigung von Matthias Nagel, Bremerhaven.
Abb. 1.4 Halobakterien färben eine Saline auf Lanzarote rot. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 1.5 EHEC O157-H7 auf Fibroblast. REM-Aufnahme, Vergrößerung 40 000×. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde (HZI), Braunschweig.
Abb. 1.6 Escherichia coli-Zelle auf einem Makrophagen. REM-Aufnahme, Vergrößerung 40 000×. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde (HZI), Braunschweig.

2 Rahmenbedingungen für den Betrieb mikrobiologischer Laboratorien

Abb. 2.1 Staphylococcus aureus. REM-Aufnahme, Vergrößerung 25 000-fach. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde, HZI, Braunschweig.

3 Kalibrierung und Qualifizierung der Geräte

Abb. 3.1 Beispiele für Messgeräteetiketten: Grüne, runde Kalibriersticker, an denen der Kalibriermonat durch Ausschneiden mit einer Spezialzange markiert wird. Blaue Label für nicht zu kalibrierende Geräte (z. B. Vortex, Schüttler, Mühlen, Büretten, bei denen das exakte Entnahmevolumen unwichtig ist), rote Aufkleber für außer Betrieb gesetzte Geräte.
Abb. 3.2 Balkenwaage aus früheren Zeiten.
Abb. 3.3 Ampulle mit externem Thermofühler, daneben der Bioindikotor (Sterikon^®Ampulle). Mit freundlicher Genehmigung von Udo Zachert, Merck KGaA, Darmstadt.

4 Stammhaltung

Abb. 4.1 Schema der Passagen.

5 Betriebshygiene

Abb. 5.1 Hygieia-Brunnen im Hof des Hamburger Rathauses, errichtet nach der Choleraepidemie 1892 mit fast 17 000 Erkrankten und 8605 Toten. Hygieia steht auf einem Drachen, Symbol für die besiegte Cholera. Der hochgehaltenen Schale entspringt frisches Wasser. Neben der mangelhaften Hygiene in der Altstadt, in der sehr viele Menschen zusammengeballt, zum großen Teil in Kellerwohnungen lebten, war die ungefilterte Entnahme des Elbewassers, das im heißen Sommer des Jahres 1892 ungewöhnlich warm war, zur Verwendung als Trinkwasser maßgeblich für die Epidemie verantwortlich.
Abb. 5.2 Abdruck zweier Finger einer ungewaschenen Hand auf einer Kontaktplatte mit Nährmedium CSA.
Abb. 5.3 Standardisierte Einreibemethode für die hygienische Händedesinfektion nach CEN pr.EN 1500.
Abb. 5.4 Anlegen von Haarnetz, Bart- und Mundschutz.
Abb. 5.5 Einmalkleidung für Besucher und Wartungspersonal in RRK „D“. Overall aus Tyvek^®, Überschuhe aus Kunststoff und Haarnetz werden benutzt.
Abb. 5.6 Kleidung für Mitarbeiter in RRK „B“. Die benutzte Reinraumkleidung wird gesammelt, gewaschen und sterilisiert.
Abb. 5.7 Laufspuren eines Kornkäfers (Sitophilus sp.) auf einer Agarplatte (CSA).

6 Umgebungsmonitoring

Abb. 6.1 Sedimentationsplatte (CSA). Typisch für Bakterien in der Luft (airborne bacteria) ist das Vorhanden von Pigmenten, die als UV-Schutz dienen. Daher werden auf Sedimentationsplatten häufig gefärbte Kolonien angetroffen. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 6.2 Verschließbare Kontaktplatten mit CSA und vier Neutralisatoren. Kontakt von optisch sauberen Labortischoberflächen (Edelstahl). Beide Platten wurden nach ihrer Inkubation bei 20–25 °C vier Monate im Kühlschrank (2–8 °C) aufbewahrt, bis sie fotografiert wurden.
Abb. 6.3 Am Beispiel Aqua purificata, Aktionslimit 100 KBE/ml gemäß Ph. Eur. [3], Warnlevel auf 50 % des Aktionslevels und Akzeptanzlevels (Toleranzlevel) auf 30 % festgesetzt.
Abb. 6.4 Verdeutlichung des Warn- und Aktionslevels.
Abb. 6.5 Typische, gelbe Kolonien von Micrococcus luteus, mit positiver Katalasereaktion. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 6.6 Micrococcus luteus im Mikroskop, Vergrößerung 400×, Nikon-Fotomikroskop. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 6.7 Bacillus atrophaeus auf CSA. Vor der Umbenennung hieß diese Bacillusspezies Bacillus subtilis (globigii).
Abb. 6.8 Bacillus cereus. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TUDortmund.
Abb. 6.9 Serratia marcescens auf CSA, isoliert im Umgebungsmonitoring, identifiziert mittels Vitek 2. Blutrote Kolonien wurden bei Isolaten aus dem Monitoring in Reinräumen nicht beobachtet.
Abb. 6.10 Pseudomonas sp. unter UV-Licht fotografiert. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU-Dortmund.

7 Qualitätskontrolle

Abb. 7.1 Schema der mikrobiologischen Qualitätskontrolle von Solida. Mit freundlicher Genehmigung von Peter Hilgendorf, Pfaffenhofen.
Abb. 7.2 Aktivierungskaskade in den Amoebocyten, getriggert durch Endotoxine (Faktor C-Weg) und 1,3-β-D-Glucane (Faktor G-Weg). B^*, C^*, G^* sind die aktivierten Faktoren B, C und G.
Abb. 7.3 Diaporama von Pfeilschwanzkrebsen (Modellen), ausgestellt im Oceanum, Stralsund.
Abb. 7.4 Gelierungsreaktion im Röhrchen: links Gelierung = endotoxinpositive Reaktion. Rechts ist die Probe flüssig geblieben (= endotoxinnegativ).
Abb. 7.5 Benötigte Reagenzien einschließlich humanem Vollblut eines Spenders, Messgerät: Mikrotiterplatten-Reader.
Abb. 7.6 Biokorrosion eines Farblacks. Mit freundlicher Genehmigung von Monika Lamoratta Lanxess, Leverkusen.
Abb. 7.7 Zur Kontrolle des Sterilisationserfolges im Autoklaven: Autoklavenband (Erscheinen von braunen Strichen), Bioindikatorstreifen und Bioindikatorampullen (Sterikon^® plus). Bei Letzteren bleibt die Farbe des Inhalts rötlich-violett und klar, wenn die Sterilisation erfolgreich war. Anderenfalls erscheint eine Trübung und ein Farbumschlag nach Gelb.
Abb. 7.8 Der Bioindikator Bacillus stearothermophilus ist auf runden Stahlplättchen aufgebracht. Die Plättchen liegen am Boden der Röhrchen. Das Foto zeigt die Ergebnisse nach sieben Tagen Inkubation: Röhrchen links außen: Negativkontrolle ohne Bioindikator, keine Trübung. 2. Röhrchen von links: Positivkontrolle mit Bioindikator, ohne sterilisierende Behandlung, Trübung. Alle anderen Röhrchen enthalten den behandelten Bioindikator, keine Trübung, d. h., der Bioindikator wurde abgetötet.
Abb. 7.9 Formel von Gentamicin.

8 Prozessvalidierungen

Abb. 8.1 Auswertearbeitsplatz nach Ph. Eur., Kapitel 2.9.20 „Prüfung auf sichtbare Partikel“. Mit freundlicher Genehmigung von Labor L & S AG, Bad Bocklet.

9 Mikrobiologische Untersuchung von Wasser

Abb. 9.1 Künstlicher Biofilm mit Pseudoalteromonas ruthenica auf einer Keramikplatte. REMAufnahme, Vergrößerung 5000-fach. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Lohmeyer, Mikrobiologisches Labor, Münster.
Abb. 9.2 Die Innenwandung des Edelstahlkessels (Volumen 5000 l) zeigt Rouging. Der Kessel wird zur Aufbewahrung von WfI genutzt [13].
Abb. 9.3 Legionellen-Kolonien auf GVPC -Agar. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Lohmeyer, Mikrobiologisches Labor, Münster.
Abb. 9.4 Typische Spiegeleikolonien von Legionella pneumophilia. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Lohmeyer, Mikrobiologisches Labor, Münster.

10 Mikrobiologische Schnellmethoden (Rapid Microbiological Methods)

Abb. 10.1 Chemische Formel von Adenosin-5’-triphosphat.
Abb. 10.2 Umwandlung von 5(6)-Carboxy-Fluorescein-Diacetat (CFDA) in 6-Carboxy-Fluorescein durch endogene Esterasen. Die chemische Formel zeigt das Molekül 6-Carboxy-Fluorescein.
Abb. 10.3 Fluoreszierende Kolonien von Aspergillus brasiliensis. Mit freundlicher Genehmigung von [10].

12 Qualitätssicherung

Abb. 12.1 Fischgrät-Diagramm beispielhaft für den LAL-Test, erstellt mit MS-Visio.
Abb. 12.2 Fehlermöglichkeiten- und Einflussgrößen-Analyse (FMEA) beispielhaft für den LAL-Test.
Abb. 12.3 Fischgrät-Diagramm beispielhaft für die Prüfung auf TAMC und TYMC, erstellt mit MS-Visio.

13 Identifizierung von Mikroorganismen

Abb. 13.1 Phasenkontrast, Vergrößerung 400×. Nikon-Fotomikroskop. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, Universität Dortmund.
Abb. 13.2 Darstellung der Kapsel von Bacillus megaterium mit China Ink. Vergrößerung 400×. Nikon Fotomikroskop. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 13.3 Modifizierte Gramfärbung von Escherichia coli (gramnegativ, rot) und Staphylococcus aureus (grampositiv, blau) mit phenolfreien Reagenzien. Mit freundlicher Genehmigung von Daniela Grabis (Merck KGaA, Darmstadt).

14 Reinigung, Sterilisation, Dekontamination und Entsorgung

Abb. 14.1 Sinnerscher Kreis.
Abb. 14.2 Gasbildung in einer Konservendose („Bombage“), hervorgerufen durch Gärung von anaeroben Clostridien. Der Dosendeckel ist im Normalfall wegen des herrschenden Unterdrucks nach innen gewölbt. Mit freundlicher Genehmigung von Matthias Nagel, Bremerhaven.

Adressen

Abb. 17.1 BfArM in Bonn-Bad Godesberg.
Abb. 17.2 EDQM in Strasbourg.
Abb. 17.3 Das Paul-Ehrlich-Institut in Langen (Hessen).
Abb. 17.4 Das Robert Koch-Institut in Berlin.

2. Auflage 2017

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Umschlaggestaltung Adam Design, Weinheim, Deutschland

Satz le-tex publishing services GmbH, Leipzig, Deutschland

Print ISBN 978-3-527-34335-5
ePDF ISBN 978-3-527-81052-9
ePub ISBN 978-3-527-81050-5
Mobi ISBN 978-3-527-81051-2
oBook ISBN 978-3-527-81049-9

Vorwort zur zweiten Auflage

Für die zweite Auflage der „Pharmazeutischen Mikrobiologie“ werden die momentan aktuellen Themen „low endotoxin recovery“ und „Maskierung/Demaskierung“ in das Kapitel über den Endotoxintest aufgenommen. Wo immer möglich, werden die Bezüge zu den neuen Ausgaben der Arzneibücher Ph. Eur. 9 und USP 40/NF 35 hergestellt. Die Kapitel über den media fill und über das Wasser sind aktualisiert, das Kapitel über den Konservierungsmittelbelastungstest ist ergänzt und der Bezug zur ISO-Norm hergestellt. Die Literaturverzeichnisse sind fortgeführt, Literatur vor dem Jahre 2000 ist, sofern möglich, fortgelassen worden. Ferner erhöht sich die Anzahl der Abbildungen deutlich, die Fotos werden überwiegend in Farbe gedruckt. Viele Bilder von Bakterien (Mikroskopaufnahmen und Abbildungen von Kolonien auf der Petrischale) hat mir Herr Dr. Armin Quentmeier/TU Dortmund zur Verfügung gestellt; weitere Fotos stammen von Herrn Dr. Michael Lohmeyer/Mikrobiologisches Labor Dr. Lohmeyer, Münster, und vom Labor L + S AG, Bad Bocklet. Allen sei herzlich gedankt!

Schließlich sind die Druckfehler korrigiert. Hier danke ich auch Herrn Dr. Marcel Goverde für seine Hinweise.

Das neue Titelbild gestaltet wiederum die Darmstädter Künstlerin Veronika Emendörfer/VERO, der ich herzlich danke.

Darmstadt, im Dezember 2016

Michael Rieth

Vorwort zur ersten Auflage

In dem vorliegenden Buch werden die Aufgaben und Tätigkeiten der in den mikrobiologischen Laboren der pharmazeutischen Qualitätssicherung arbeitenden Biologielaboranten und Mikrobiologen beschrieben. Schwerpunkte sind die Methoden der Qualitätskontrollprüfungen einschließlich ihrer Validierungen, die Qualifizierungen und Kalibrierungen der dazu benötigten Geräte und Messinstrumente, das Umgebungsmonitoring in der Pharma- und Chemieproduktion sowie die Betriebshygiene. Eine derartige Zusammenfassung fehlte bisher in der deutschsprachigen Fachliteratur. Vorgestellt werden in erster Linie bakteriologische Methoden und Verfahren, jedoch werden auch Verweise auf Zellkulturmethoden und Tiermodelle gegeben. Moderne Techniken, Schlagwort „rapid microbiological methods“ werden ebenfalls vorgestellt. Vor allem bei Verfahren mit langen Inkubationszeiten wie beim Steriltest und der Prüfung auf Mykobakterien und Mykoplasmen werden kürzere Analysenzeiten benötigt. Die Zukunft wird zeigen, ob diese Verfahren die klassischen Kultivierungstechniken, die größtenteils auf Robert Koch und andere Bakteriologen des späten 19. Jahrhunderts zurückgehen, dauerhaft ersetzen können.

Herzlich danke ich folgenden Kolleginnen und Kollegen für die Überlassung von Fotos und Abbildungen: Daniela Grabis (Merck KGaA), Monika Lamoratta (Lanxess Deutschland GmbH, Leverkusen), Peter Hilgendorf (Daiichi Sankyo Europe GmbH, Pfaffenhofen), Matthias Nagel (Hochschule Bremerhaven), Armin Quentmeier (Universität Dortmund) und Manfred Rohde (Helmholtz-Zentrum für Infektionskrankheiten, Braunschweig). Barbara Gerten (Merck KGaA) danke ich für wertvolle Anregungen und Literaturhinweise.

Ganz besonders danke ich der Künstlerin Veronika Emendörfer/VERO für das Titelbild.

Darmstadt, im Januar 2012

Michael Rieth

Abkürzungen

AL	Aktionslimit (Aktionslevel)
AMG	Arzneimittelgesetz
AMWHV	Arzneimittel- und Wirkstoffherstellungsverordnung
AP	Aqua purificata
API	analytical process index
at	Atmosphäre
ATCC	American Type Culture Collection
ATP	Adenosin-5′-triphosphat
a_w	Wasseraktivität
BBS	Beauftragter für Biologische Sicherheit
BfArM	Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte
BG	Berufsgenossenschaft
BG RCI	Berufsgenossenschaft Rohstoffe und Chemische Industrie
BiostoffV	Biostoffverordnung
BLV	Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
BMELV	Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz
BMwA	Bundesamt für wirtschaftliche Angelegenheiten (Österreich)
BP	British Pharmacopeia oder bubble point
BPLS	Brilliantgrün Phenolrot Laktose Saccharose Nährmedium
BSE	Bovine spongiforme Enzephalopathie
CCIT	container closure integrity test
CCOS	Culture Collection of Switzerland
CDC	Centers for Disease Control and Protection
CDCP	Centers for Disease Control and Prevention
CFDA	5(6)-Carboxy-Fluorescein-Diacetat
CHCA	α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
cft	cubic feet
CIP	Collection de l’Ínstitut Pasteur oder cleaning in place
CLED	Cystein-Lactose-Elektrolyt-defizientes Nährmedium
cm	Zentimeter
CPM	Curriculum für pharmazeutische Mikrobiologie
CSA	Casein-Sojamehlpepton-Agar (= TSA)
CSB	Casein-Sojamehlpepton-Bouillon (= TSB)
d	Tag oder Durchmesser
Da	Dalton, Einheit der relativen molaren Masse, 1 Da = 1,66018 × 10⁻²⁴ g
DAB	Deutsches Arzneibuch
DAkkS	Deutsche Akkreditierungsstelle
DAPI	4′,6-Diamidin-2-phenylindol
DEHS	Diethylhexylsebacinsäure
DEV	Deutsches Einheitsverfahren
DGFM	Deutsche Gesellschaft für Mykologie e. V.
DGHM	Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie e. V.
DIF	Direkte Immunfluoreszenz
DIMDI	Deutsches Institut für Medizinische Dokumentation und Information
DIN	Deutsche Industrienorm
DKD	Deutscher Kalibrierdienst
DMSO	Dimethylsulfoxid
DNA	Desoxyribonukleinsäure
DOP	Dioctylphthalat
DQS	Deutsche Gesellschaft zur Zertifizierung von Managementsystemen
DSM	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
DSMZ	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
EAM	Eidgenössisches Amt des Messwesens (Schweiz)
ECCO	European Culture Collections Organization
EDQM	European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare
EDTA	Ethylendiamintetraessigsäure
EE	Endotoxineinheiten
EEU	endotoxin equivalent unit
EHEC	enterohämorrhagische Escherichia coli
ELC	endotoxin limit concentration
ELISA	enzyme-linked immuno sorbent assay
EtOH	Ethanol
EU	endotoxin unit (1 EU = 1 EE = 1 IU = 1 IE)
FAME	fatty acid methyl ester
FDA	Food and Drug Administration
FLI	Friedrich-Löffler-Institut
GBF	Gesellschaft für Biotechnologische Forschung
GenTG	Gentechnikgesetz
GLP	good laboratory practice
GMP	good manufacturing practice
GSF	Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung
GVPC	Glycin-, Vancomicin-, Polymixin-, Cycloheximidagar
h	Stunde
HEPA	high efficiency particulate airfilter
HPW	highly purified water
HRP	horseraddish peroxidase
HUS	hämolytisch-urämisches Syndrom
HZI	Helmholtz-Zentrum für Infektionskrankheiten GmbH
IDA	International Depositary Authority
IfSG	Infektionsschutzgesetz
IPA	Isopropylalkohol
IPT	In-vitro-Pyrogen-Test
IQ	installation qualification
ISO	International Standardization Organization
IU	Internationale Einheiten
IVSS	Internationale Vereinigung für Soziale Sicherheit
JP	Japanische Pharmakopöe
KBE	Koloniebildende Einheiten (engl. CFU, colony forming units)
λ	Lysatempfindlichkeit Lambda
l	Liter
LAL	Limulus Amoebocyten Lysat
LER	low endotoxin recovery
LF	laminar flow
LMX	Laurylsulfat MUG X-Galaktopyranosid
LPS	Lipopolysaccharid
LRW	LAL-Reagenz-Wasser (Ph. Eur.: Wasser zur BEP) oder limulus reagent water
LTA	lipoteichoic acid (Lipoteichonsäure)
MALDI/TOF	matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight
MAT	Monozytenaktivierungstest
m-CP	modifizierter Cellobiose-Polymixin B-Agar
min	Minute
MPG	Medizinproduktegesetz
MRI	Max-Rubner-Institut
MRS	Lactobacillus-Agar nach de Man, Rogosa und Sharpe
MVD	maximum valid dilution
NAT	Amplifikation von Nukleinsäuren
NCTC	National Collection of Type Cultures
NCYC	National Collection of Yeast Cultures
OB	Objektträger
OOC	out of calibration
OD	optische Dichte
ODC	Ornithindecarboxylase
ÖKD	Österreichischer Kalibrierdienst
OF	Oxidation/Fermentation
ONGP	o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
OOE	out of expectation
OOL	out of limit/out of level
OOS	out of specification
OOT	out of trend
PAO	Polyalphaolefine
PBS	phosphatgepufferte Saline
PCR	Pseudoselagar oder Polymerasekettenreaktion
PDA	Parenteral Drug Association
PEI	Paul-Ehrlich-Institut
Ph. Eur.	Europäische Pharmakopöe
pNA	p-Nitroanilin
POD	Peroxidase
PPC, PPK	Produktpositivkontrolle
PSA	persönliche Schutzausrüstung
PVP	Polyvinylpyrrolidon (= Povidon)
PVDF	Polyvinylidenfluorid
PTB	Physikalisch Technische Bundesanstalt
RCM	reinforced clostridial medium
REM	Rasterelektronenmikroskopie
RIA	Radioimmunoassay
RKI	Robert-Koch-Institut
RLU	relative light unit oder relative Lichteinheiten
RNA	Ribonukleinsäure
RRK	Reinraumklasse
s	Sekunde
SAL	sterility assurance level
SARS	severe acute respiratory syndrome
SAS	Swiss Accreditation Service
SDA	Sabouraud-Dextrose-Agar
SIM	Sulfid- und Indolbildung, Motilität
SOP	standard operation procedure (Standardarbeitsanweisung)
TAMC	total aerobic microbial count
TEM	Transmissionselektronenmikroskopie
TierSeuchErV	Tierseuchenerregerverordnung
TMB	Tetramethylbenzidin
TRBA	Technische Regeln Biologische Arbeitsstoffe
TrinkwasserV	Trinkwasserverordnung
TSA	tryptic soybean agar
TSB	tryptic soybean bouillon
TTC	Triphenyltetrazoliumchlorid
TÜV	Technischer Überwachungsverein
TVO	(deutsche) Trinkwasserverordnung
TYMC	total yeast and mould count
UF	Ultrafiltration
Upm	Umdrehungen pro Minute
UPU	Weltpostunion
USP	United States Pharmacopeia
UVV	Unfallverhütungsvorschrift
VAAM	Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie
VAH	Verbund Angewandte Hygiene
VBG	Verordnung der Berufsgenossenschaft
VBNC	viable but non-culturable
VE	vollentsalzt
VfA	Verband forschender Arzneimittelhersteller e. V.
VHP	vaporized hydrogen peroxide (gasförmiges Wasserstoffperoxid)
VI	Vorbeugende Instandhaltung
VRBA	violet red bile agar
VRBD	violet red bile dextrose (Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Dextrose)
WFCC	World Federation for Culture Collections
WfI	Wasser für Injektionszwecke
WL	Warnlimit
WHO	World Health Organization
WST	working standard
XLD	Xylose-Lysin-Deoxycholat-Agar
ZEBET	Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch
ZLG	Zentralstelle der Länder für Gesundheitsschutz bei Arzneimitteln und Medizinprodukten

Pharmazeutische Mikrobiologie

Qualitätssicherung, Monitoring, Betriebshygiene

Vorwort zur zweiten Auflage

Vorwort zur ersten Auflage

Abkürzungen