Inhaltsverzeichnis

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Impressum

Geleitwort

Vorwort

Vorwort zur ersten Auflage

Abkürzungen

Teil I: Grundlagen

1 Elektrophorese
1. 1.1 Allgemeines
2. 1.2 Elektrophoresen in nicht restriktiven Gelen
3. 1.3 Elektrophorese in restriktiven Gelen
2 Isotachophorese
1. 2.1 Wanderung mit gleicher Geschwindigkeit
2. 2.2 Trennung der Substanzen in der Form einer Kette ion train
3. 2.3 Zonenschärfungseffekt
4. 2.4 Konzentrationsregulierungseffekt
3 Isoelektrische Fokussierung
1. 3.1 Prinzip
2. 3.2 Gele für die IEF
3. 3.3 Temperatur
4. 3.4 Kontrolle des pH-Gradienten
5. 3.5 Arten von pH-Gradienten
6. 3.6 Präparative Isoelektrische Fokussierung
7. 3.7 Titrationskurvenanalyse
4 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese
1. 4.1 IEF in IPG-Streifen
2. 4.2 SDS-PAGE
3. 4.3 Proteomik
5 Proteinprobenvorbereitung
1. 5.1 Proteinquantifizierungsmethoden
2. 5.2 Vorbereitung von nativen Proben
3. 5.3 Proben für die SDS-Elektrophorese
4. 5.4 Proben für die hochauflösende 2-D-PAGE
6 Proteindetektion
1. 6.1 Fixierung
2. 6.2 Färbungen nach der Elektrophorese
3. 6.3 Proteinmarkierung
4. 6.4 Differenzgelelektrophorese (DIGE)
5. 6.5 Bildaufzeichnung, Bildanalyse, Spotpicken
7 Blotting
1. 7.1 Transfermethoden
2. 7.2 Blotmembranen
3. 7.3 Puffer für elektrophoretische Transfers
4. 7.4 Allgemeine Anfärbung
5. 7.5 Blockieren
6. 7.6 Spezialdetektion
7. 7.7 Proteinsequenzierung
8. 7.8 Transferprobleme
9. 7.9 Elektroelution von Proteinen aus Gelen

Teil II: Praktische Methodenanleitungen –Ausrüstung und Methoden

Methode 1: PAGE von Farbstoffen
1. M1.1 Probenvorbereitung
2. M1.2 Stammlösungen
3. M1.3 Vorbereitung der Gießkassette
4. M1.4 Gießen der ultradünnen Gele
5. M1.5 Elektrophoretische Trennung
Methode 2: Agarose- und Immunelektrophoresen
1. M2.1 Probenvorbereitung
2. M2.2 Stammlösungen
3. M2.3 Herstellung der Gele
4. M2.4 Elektrophoresen
5. M2.5 Proteinnachweis
Methode 3: Titrationskurvenanalyse
1. M3.1 Probenvorbereitung
2. M3.2 Stammlösungen
3. M3.3 Herstellung der leeren Gele
4. M3.4 Titrationskurvenelektrophorese
5. M3.5 Coomassie- und Silberfärbung
6. M3.6 Interpretation der Kurven
Methode 4: Native PAGE in amphoteren Puffern
1. M4.1 Probenvorbereitung
2. M4.2 Stammlösungen
3. M4.3 Herstellung der leeren Gele
4. M4.4 Elektrophorese
5. M4.5 Coomassie- und Silberfärbung
Methode 5: Agarosegel-IEF
1. M5.1 Probenvorbereitung
2. M5.2 Herstellung des Agarosegels
3. M5.3 Isoelektrische Fokussierung
4. M5.4 Proteinnachweis
Methode 6: PAGIEF in rehydratisierten Gelen
1. M6.1 Probenvorbereitung
2. M6.2 Stammlösungen
3. M6.3 Herstellung der leeren Gele
4. M6.4 Isoelektrische Fokussierung
5. M6.5 Coomassie- und Silberfärbung
6. M6.6 Methodischer Ausblick
Methode 7: Horizontale SDS-Polyacrylamidelektrophorese
1. M7.1 Probenvorbereitung
2. M7.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff
3. M7.3 Stammlösungen für die Gelherstellung
4. M7.4 Vorbereitung der Gießkassette
5. M7.5 Gradienten-Gel
6. M7.6 Elektrophorese
7. M7.7 Coomassie- und Silberfärbung
8. M7.8 Blotting
9. M7.9 Methodischer Ausblick
Methode 8: Vertikale PAGE
1. M8.1 Probenvorbereitung und Proteinmarkierung
2. M8.2 Stammlösungen für die SDS-PAGE
3. M8.3 Gießen von Einzelgelen
4. M8.4 Gießen von Mehrfachgelen
5. M8.5 Elektrophorese
6. M8.6 SDS-Elektrophorese von niedermolekularen Peptiden
7. M8.7 Zweidimensional-Elektrophorese
8. M8.8 DNA-Elektrophorese
9. M8.9 Langzeitstabile Gele
10. M8.10 Proteindetektion
11. M8.11 Präparieren von Glasplatten mit Bind-Silan
Methode 9: Blau-Nativ-PAGE
1. M9.1 Solubilisierung
2. M9.2 Stammlösungen
3. M9.3 Gießen der Gele
4. M9.4 Elektrophorese
Methode 10: Semidry-Blotting von Proteinen
1. M10.1 Transferpuffer
2. M10.2 Technische Durchführung
3. M10.3 Färbung von Blotfolien
Methode 11: IEF im immobilisierten pH-Gradienten
1. M11.1 Probenvorbereitung
2. M11.2 Stammlösungen
3. M11.3 Immobilinerezepturen
4. M11.4 Vorbereitung der Gießkassette
5. M11.5 Herstellung der pH-Gradientengele
6. M11.6 Isoelektrische Fokussierung
7. M11.7 Coomassie- und Silberfärbung
8. M11.8 Strategien der IPG-Fokussierung
Methode 12: Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese
1. M12.1 Probenvorbereitung
2. M12.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff
3. M12.3 Stammlösungen für die Gelherstellung
4. M12.4 Gelherstellung
5. M12.5 SDS-Porengradientengele
6. M12.6 Trennbedingungen
7. M12.7 Proteindetektion
Methode 13: Zweidimensional-Differenzgelelektrophorese (DIGE)
1. M13.1 Planung eines Experiments
2. M13.2 Probenvorbereitung
3. M13.3 DIGE-Markierung
4. M13.4 Vorbereitung für die Probenaufgabe auf die IPG-Streifen
5. M13.5 Detektion der DIGE-Spots
Methode 14: PAGE von DNA-Fragmenten
1. M14.1 Stammlösungen
2. M14.2 Herstellung der Gele
3. M14.3 Probenvorbereitung
4. M14.4 Elektrophorese
5. M14.5 Silberfärbung
Anhang A: Problemlösungen
1. A.1 Häufige Fehler
2. A.2 Isoelektrische Fokussierung
3. A.3 SDS-Elektrophorese
4. A.4 Zweidimensional-Elektrophorese
5. A.5 Semidry-Blotting
6. A.6 PAGE von DNA-Fragmenten

Stichwortverzeichnis

Endbenutzer-Lizenzvereinbarung

List of Tables

1 Elektrophorese

Tab. 1.1 Vergleich von horizontalen Flachbett- und vertikalen Gelsystemen.

Teil II: Praktische Methodenanleitungen –Ausrüstung und Methoden

Tab. II.1 Laborausrüstung.
Tab. II.2 Verbrauchsmaterial.
Tab. II.3 Chemikalien.

Methode 3: Titrationskurvenanalyse

Tab. M3.1 Zusammensetzung der Polymerisationslösung für ein Gel mit T = 4,2 %.

Methode 4: Native PAGE in amphoteren Puffern

Tab. M4.1 Zusammensetzung der Polymerisationslösungen.
Tab. M4.2 Rehydratisierlösung (0,6 mol/L HEPES).
Tab. M4.3 Stromversorgerprogramm für die Nativelektrophorese.

Methode 5: Agarosegel-IEF

Tab. M5.1 Elektrodenlösungen für die IEF in Agarosegelen.

Methode 6: PAGIEF in rehydratisierten Gelen

Tab. M6.1 Stromversorger Programm für die PAGIEF.
Tab. M6.2 Protokoll der ammoniakalischen Silberfärbung.
Tab. M6.3 Elektrodenlösungen für die IEF in Polyacrylamidgelen.

Methode 7: Horizontale SDS-Polyacrylamidelektrophorese

Tab. M7.1 Zusammensetzung der Monomerlösungen für zwei Gradientengele 8–20 % T und einem Probenaufgabeplateau mit 5 % T.
Tab. M7.2 Füllvolumen und Katalysatormengen.
Tab. M7.3 Stromversorgerprogramm für die SDS-Elektrophorese.
Tab. M7.4 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1985).

Methode 8: Vertikale PAGE

Tab. M8.1 Zusammensetzung der Monomerlösungen für zwei diskontinuierliche Gele.
Tab. M8.2 Zusammensetzung der Monomerlösungen für zwei Gradientengele.
Tab. M8.3 Zusammensetzung der Monomerlösungen für zwölf diskontinuierliche Gele.
Tab. M8.4 Zusammensetzung der Monomerlösungen für Gradientengele.
Tab. M8.5 Monomerlösungen für zwei Gele für die Auftrennung von niedermolekularen Peptiden.

Methode 9: Blau-Nativ-PAGE

Tab. M9.1 Monomerlösungen für ein BNE-Gel (18 × 24 cm, 1 mm).

Methode 11: IEF im immobilisierten pH-Gradienten

Tab. M11.1 Enge pH-Gradienten: Immobilinemengen für 15 mL der jeweiligen Starterlösung (zwei Gele), 0,2 mol/L Immobiline in μL.
Tab. M11.2 Weite pH-Gradienten: Immobilinemengen für 15 mL der jeweiligen Starterlösung (zwei Gele), 0,2 mol/L Immobiline in μL.
Tab. M11.3 Herstellung der Starterlösungen für zwei 0,5 mm dicke IPG-Gele pH 4–10, T = 4 %, C = 3 %.
Tab. M11.4 Rehydratisieren von Immobilinegelen.

Methode 12: Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese

Tab. M12.1 Zusammensetzungen der Polymerisationslösungen von IPG-Gelen.
Tab. M12.2 Pipettiervolumen für den Gradientenmischer.
Tab. M12.3 Herstellung der drei Gelgießlösungen für einen Gradienten T = 12−15 % und ein Plateau mit T = 6 %. Das superschwere Plateau vermischt sich nicht mit dem Gradienten.
Tab. M12.4 Volumen der Gießlösungen für Standard- und Large-Scale-Gelformate.
Tab. M12.5 Strombedingungen für die IPG-IEF in herkömmlicher Ausrüstung.
Tab. M12.6 Laufbedingungen für 11 und 24 cm IPG-Streifen (20 °C).
Tab. M12.7 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1985).

Methode 13: Zweidimensional-Differenzgelelektrophorese (DIGE)

Tab. M13.1 Beispiele von Anregungswellenlängen und die Auswahl der entsprechenden Emissionsfilter für die Aufzeichnung von DIGE-Gelen.

Methode 14: PAGE von DNA-Fragmenten

Tab. M14.1 Zusammensetzung der Gellösungen für ein Gel.
Tab. M14.2 Stromversorgereinstellungen für eine lange Trenndistanz.
Tab. M14.3 Empfindliche Silberfärbung für Nukleinsäuren (20–50 pg pro Bande).

Anhang A: Problemlösungen

Tab. A.1 Geleigenschaften.
Tab. A.2 Effekte beim IEF-Lauf.
Tab. A.3 Trennergebnisse.
Tab. A.4 Geleigenschaften.
Tab. A.5 Effekte beim IEF-Lauf.
Tab. A.6 Trennergebnisse.
Tab. A.7 Agarosegel-IEF-spezifische Färbeprobleme.
Tab. A.8 Geleigenschaften.
Tab. A.9 Effekte beim Waschen.
Tab. A.10 Effekte beim Trocknen.
Tab. A.11 Effekte beim Rehydratisieren.
Tab. A.12 Effekte beim IEF-Lauf.
Tab. A.13 Trennergebnisse.
Tab. A.14 IPG-spezifische Färbeprobleme.
Tab. A.15 Gelgießen.
Tab. A.16 Effekte bei der Elektrophorese.
Tab. A.17 Trennergebnisse.
Tab. A.18 SDS-PAGE-spezifische Färbeprobleme.
Tab. A.19 Trocknen.
Tab. A.20 Gelherstellung.
Tab. A.21 Effekte bei der Elektrophorese.
Tab. A.22 Trennergebnisse.
Tab. A.23 Trocknen.
Tab. A.24 1. Dimension: IEF im immobilisierten pH-Gradienten.
Tab. A.25 2. Dimension: Horizontale SDS-Elektrophorese.
Tab. A.26 DIGE-Fluoreszenzmarkierung.
Tab. A.27 Aufbau des Blot-Sandwiches.
Tab. A.28 Effekte während des Blottens.
Tab. A.29 Nach dem Blotten.
Tab. A.30 Ergebnisse.
Tab. A.31 Nachweis.
Tab. A.32 Probenvorbereitung.
Tab. A.33 Effekte bei der Elektrophorese.
Tab. A.34 Silberfärbung.

List of Illustrations

Teil I: Grundlagen

Abb. 1 Die drei elektrophoretischen Trennprinzipien. Nähere Erläuterungen im Text.
Abb. 2 Elektroendosmose: Negative Ladungen auf der stationären Phase (Gelmatrix und Oberflächen der Apparaturen) verursachen die Strömung von positiv geladenen Wasserionen in Richtung Kathode. Daraus resultiert ein Wassertransport entgegen der Richtung der elektrophoretischen Wanderung der Probeionen; das führt zu unscharfen Zonen.

1 Elektrophorese

Abb. 1.1 Wandernde-Grenzschichten-Elektrophorese in einem U-Rohr nach Tiselius. Messung der elektrophoretischen Mobilität mit Schlierenoptik.
Abb. 1.2 Schematische Darstellung der kontinuierlichen trägerfreien Elektrophorese (Free-Flow-System).
Abb. 1.3 Schematische Darstellung eines Kapillarelektrophoresesystems.
Abb. 1.4 Schematische Darstellung der Mikrochipelektrophorese.
Abb. 1.5 Chemische Formel der Agarose und Ausbildung der Gelstruktur beim Gelieren.
Abb. 1.6 Die Polymerisation von Acrylamid und Methylenbisacrylamid.
Abb. 1.7 Gelgeometrien für elektrophoretische Trennungen.
Abb. 1.8 Schematische Darstellung der Zusammenhänge zwischen den Dimensionen des Trennmediums und Strom-, Spannungs- und Leistungsbedingungen bei Elektrophoresen.
Abb. 1.9 Verlauf der elektrischen Parameter während einer Disk-Elektrophorese und einer Isoelektrischen Fokussierung.
Abb. 1.10 Unterschiedliche Konstruktionen von Vertikalkammersystemen. (a) Einfache ungekühlte Vorrichtung mit oberem und unterem Pufferreservoir. (b) Konstruktion mit großem „oberen“ Puffertank, der auch als Wärmeausgleich dient; optional mit Wasser kühlbar über Schläuche. (c) System mit großem unteren Puffertank der ebenfalls als Wärmeausgleich dient; optional mit Wasser kühlbar über Schläuche. (d) Kassettenaufbau für die Systeme A und B mit einer Glasplatte mit eingekerbter Aussparung. (e) Plastikkassette mit Fertiggel. (f) Gießstand mit Kassette für das System C mit zwei Glasplatten mit glatten Oberkanten.
Abb. 1.11 Submarine-Kammer für Nukleinsäuretrennungen. (a) Gießwanne; (b) Agarosekammer während der Elektrophorese.
Abb. 1.12 System für die DNA-Gelelektrophorese im gepulsten Feld (PFG). (a) PFG-Submarine-Trennkammer mit Kühlschlange und Pufferzirkulationspumpe (nicht gezeigt). (b) Programmierbares Pulssteuergerät. (c) Hexagonalelektrode zum Geradeauslauf der Trennspuren.
Abb. 1.13 Verschiedene Horizontalelektrophoresekammern: (a) Trennkammer mit Kühlplatte und seitlichen Puffertanks. (b) Trennkammer in Gehäuse mit Schubladenkühlplatte ohne Puffertanks. (c) Gelgießkassette für dünne homogene und Gradientengele. (d) Anordnung eines Horizontalgels auf Trägerfolie mit in konzentrierten Puffern getränkten Elektrodendochten.
Abb. 1.14 Agarosegelelektrophorese von Lactatdehydrogenase-Isoenzymen. Spezifische Anfärbung mit Zymogrammtechnik.
Abb. 1.15 Die drei Prinzipien der Immunelektrophorese: (a) Gegenstromelektrophorese; (b) Zonenelektrophorese/Immundiffusion; (c) Rocket-Technik; für nähere Erläuterungen siehe Text.
Abb. 1.16 Affinitätselektrophorese von Isoenzymen der alkalischen Phosphatase aus Leber und Knochen. Das Weizenkeimagglutinin bindet spezifisch die Knochenfraktion, die als charakteristische Bande nahe der Auftragsstelle erkennbar ist. Zymogramm-Detektion für alkalische Phosphatase.
Abb. 1.17 Ferguson Plots: Auftragung der elektrophoretischen Wanderungsstrecken von Proteinen über Gel-Konzentrationen. (a) Lactatdehydrogenase-Isoenzyme; (b) verschiedenartige Proteine. Nähere Erläuterung im Text.
Abb. 1.18 „Submarine“-Technik für Nukleinsäuretrennungen.
Abb. 1.19 Feldlinien und Trennergebnis bei zwei verschiedenen Elektrodenanordnungen der PFG: (a) Zweifach inhomogene Felder bei rechtwinklig und (b) homogene Felder bei hexagonal angeordneten Punktelektroden.
Abb. 1.20 Apparative Anordnung der automatisierten DNA-Sequenzierung. Auf dem Computerbildschirm: typisches Trennergebnis nach Aufbereitung der Rohdaten im Computer.
Abb. 1.21 RAPD-Elektrophorese von Pilzsorten in einem horizontalen Polyacrylamidgel. Silberfärbung. Mit freundlicher Genehmigung von Birgit Jäger und Dr. Hans-Volker Tichy, TÜV Südwest GmbH – Abteilung für biologische Sicherheit, Freiburg im Breisgau.
Abb. 1.22 Schematische Darstellung des Funktionsprinzips der Disk-Elektrophorese nach Ornstein (1964). Dieses Puffersystem wird auch für die klassische diskontinuierliche SDS-Elektrophorese verwendet.
Abb. 1.23 Gießen von Gradientengelen mit einem Gradientenmischer. Der Magnetkern wird von einem Magnetrührmotor angetrieben (nicht gezeigt). (a) Linearer Gradient; (b) exponentieller Gradient.
Abb. 1.24 Proteintrennung in einem horizontalen SDS-Polyacrylamidgel T = 12,5 % (Kathode oben). Färbung mit Coomassie Brilliant Blau R-250. Proben: Humanserum, Leguminosen Samenextrakte, verschiedene Markerproteingemische.
Abb. 1.25 Molekulargewichtskurve in der halblogarithmischen Darstellung: Die Molekulargewichte von Eichproteinen sind über ihren Wanderungsstrecken aufgetragen.
Abb. 1.26 Prinzip eines diskontinuierlichen Puffersystems im Fertiggel: Horizontales Gel mit Tris-Tricin-Pufferstreifen.
Abb. 1.27 Prinzip der zweidimensionalen Elektrophorese mit Blau-Nativ-PAGE in der ersten und SDS-PAGE in der zweiten Dimension.
Abb. 1.28 Prinzip der zweidimensionalen Elektrophorese mit der sauren PAGE mit kationischem Detergens 16-BAC in der ersten und SDS-PAGE in der zweiten Dimension.
Abb. 1.29 Prinzip der Methode der hochauflösenden 2-D-Elektrophorese nach O’Farrell (1975).

2 Isotachophorese

Abb. 2.1 Die vier Fakten der Isotachophorese. (a) In einem diskontinuierlichen Puffersystem werden die Ionen gezwungen mit der gleichen Geschwindigkeit zu wandern. (b) Die Substanzionen werden voneinander getrennt, aber jede Zone wandert unmittelbar hinter der anderen her. (c) Weil die Ionen in den unterschiedlichen Feldstärkenzonen je nachdem verlangsamt oder beschleunigt werden, bilden sich scharfe Grenzen zwischen den Zonen. (d) Der Konzentrationsregulierungseffekt ist die Basis für die Quantifizierung in der Isotachophorese, weitere Erläuterungen im Text.
Abb. 2.2 Isotachophorese von Penicillinen. Nachweis der Zonen simultan mit Wärmeleitfähigkeits- und UV-Detektor. Aus dem Applikationslabor von Pharmacia LKB Bromma, heute GE Lifesciences.

3 Isoelektrische Fokussierung

Abb. 3.1 Proteinmolekül und die Abhängigkeit seiner Nettoladung vom pH-Wert. Ein Protein mit dieser Nettoladungskurve hat bei pH 5 zwei positive, bei pH 9 eine negative Nettoladung.
Abb. 3.2 Verschiedene Möglichkeiten der Probenaufgabe auf ein Horizontalgel. In diesem Beispiel sind Elektrodendochte gezeigt: (a) Tröpfchen, (b) Applikatorplättchen, (c) Applikatorstreifen, (d) Raschig-Ringe.
Abb. 3.3 Schematische Darstellung der Entwicklung eines Trägerampholyten pH-Gradienten im elektrischen Feld.
Abb. 3.4 Isoelektrische Fokussierung in einem gewaschenen, getrockneten und rehydratisierten Polyacrylamidgel. Proben: Presssäfte von Kartoffeln unterschiedlicher Sorten. Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung (Anode oben).
Abb. 3.5 Schema eines Polyacrylamidnetzwerks mit kopolymerisierten Immobilinen.
Abb. 3.6 IEF im immobilisierten pH-Gradient 4,0–5,0. Isoformen von α₁-Antitrypsin (Proteaseinhibitoren) in Humanseren. Mit freundlicher Genehmigung von Herrn Prof. Dr. Pollack und Frau Pack, Institut für Rechtsmedizin der Universität Freiburg im Breisgau (Anode oben).
Abb. 3.7 Prinzip der „Off-Gel“ Isoelektrischen Fokussierung: Die Probenkomponenten an der Oberfläche eines IPG-Streifens nach ihren isoelektrischen Punkten aufgetrennt und in kleinen Kammern eines darauf sitzenden Fraktionierrahmens angereichert. Von dort können die Fraktionen in flüssiger Form entnommen werden.
Abb. 3.8 Titrationskurven. (a) Probenauftragung in Gelrinne bei bereits etabliertem pH-Gradient; (b) Titrationskurven.
Abb. 3.9 Titrationskurven eines pI-Markerproteingemisches pH 3–10. Kathode oben.

4 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese

Abb. 4.1 Schematische Darstellung der 2-D-Elektrophorese mit IPG-Streifen. Die zweite Dimension kann in einem horizontalen Flachgel-oder vertikalen Tanksystem durchgeführt werden.
Abb. 4.2 Zweidimensional-Elektrophorese von Mäuseleberproteinen. Erste Dimension: IEF in einem 24 cm langen IPG-Streifen mit einem pH-Gradienten 3–12. Zweite Dimension: SDS-PAGE in einem 13 % T Gel. Silberfärbung. Mit freundlicher Genehmigung von Prof. A. Görg, Technische Universität München-Weihenstephan.
Abb. 4.3 Trennergebnis einer zu salzreichen Probe in der 2-D-PAGE (nach Waschen von Zellen mit PBS, phosphatgepufferter Salzlösung). Erste Dimension im IPG pH-Gradient 3–10, zweite Dimension SDS-PAGE, Coomassie-Blau-Färbung. Die hohe Menge von Salzionen verhindert das Einwandern der Proteine in die Bereiche, wo sich die Salzionen angereichert haben. E = elektrische Feldstärke, U = Spannung, d = Bereich der Proteinwanderung.
Abb. 4.4 Die Schritte beim Rehydratisieren eines IPG-Streifens.
Abb. 4.5 Schematische Darstellung der verschiedenen Möglichkeiten der Probenaufgabe auf einen IPG-Streifen: (a) Cuploading für bis zu 250 μL Probelösung. (b) Papierbrückenbeladung für bis zu 500 μL Probelösung. Teilbilder (a, b) zeigen die Beladung an der anodischen Seite, in manchen Fällen ist die Beladung an der kathodischen Seite zu bevorzugen. (c) Anordnung nach Rehydratisierungsbeladung mit Geloberfläche nach oben. (d) Rehydratisierungsbeladung und Trennung im individuellen Streifenhalter.
Abb. 4.6 Die Evolution von Instrumenten für die IEF in IPG-Streifen. (a) IPG-Wanne als Zusatzausrüstung für die Multiphor-Kammer. (b) IPGphor mit einzelnen Streifenhaltern für Rehydratisierungsbeladung (a, b erhältlich bei GE Healthcare). (c) IEF 100 (von Hoefer Inc.) für sechs IPG-Streifen mit individueller Aufzeichnung der Stromstärken. (d) PROTEAN i12 IEF System (von Bio-Rad) mit zwölf individuell stromversorgten Kanälen. (b–d) sind mit eingebauter Peltier-Kühlung und programmierbarem Stromversorger ausgerüstet.
Abb. 4.7 Unterschiedliche Konzepte für die zweite Dimension. (a) Einzelpuffertank für Vertikalgele und der Trennung in seitlicher Richtung. (b) Vertikales Zweitanksystem für die Trennung von oben nach unten. (c) Horizontales System HPE™ Tower ohne Puffertanks mit Schubladenkühlplatten und Pufferdochten.
Abb. 4.8 (a) Glaskassette für multiple Großformatgelgießstände und Trennkammern. Die Spacer sind fest auf der Glasoberfläche angebracht, die Glasplatten sind mit einem Scharnier verbunden. (b) Gießen von multiplen homogenen SDS-Gelen; Eingießen der Monomerlösung direkt in den oberen Füllkanal. Der untere Anschluss wird für das Gießen multipler Gradientengele verwendet.
Abb. 4.9 Aufbringen des IPG-Streifens und der SDS-Größenmarker auf das SDS-Gel und Einbettung mit heißer Agarose.
Abb. 4.10 Vorbereitung eines trägerfoliengestützten Horizontalgels für die zweite Dimension. (a) Tränken der Elektrodendochte mit Pufferkonzentraten. (b) Pipettieren der Kühlkontaktflüssigkeit auf die Kühlplatte. (c) Gleichmäßige Verteilung der Kühlkontaktflüssigkeit und Auflegen des Gels auf die Kühlplatte. (d) Einlegen des äquilibrierten IPG-Streifens in die Gelrinne.

5 Proteinprobenvorbereitung

Abb. 5.1 Nativzustand von Proteinen.
Abb. 5.2 SDS-behandelte Proteine ohne Reduzierung.
Abb. 5.3 SDS-behandelte und reduzierte Proteine.
Abb. 5.4 SDS-behandelte reduzierte und alkylierte Proteine.

6 Proteindetektion

Abb. 6.1 Diagramm des Anregungs- und Emissionsspektrums eines Fluorophors.
Abb. 6.2 SDS-Elektrophoresen in SERVAGel™ PRiME TG 4-20. Trennspuren 1–6: SERVA Proteintestmischung 6: 5 μg, 1 μg, 0,2 μg, 40 ng, 8 ng, 1,6 ng. Trennspuren 7–12: E. coli-Lysat mit einem Proteingehalt von 25 μg, 5 μg, 1 μg, 0,5 μg, 250 ng, 125 ng. Die Proteindetektion erfolgte mittels: (a) Färbung mit Coomassie Brillant Blau R-250; (b) Silberfärbung; (c) Färbung mit SERVA Purple; (d) Vormarkierung mit SERVA LightningRed, gescannt bei 532 nm Anregungswellenlänge mit 630 nm Bandpassfilter – Von Griebel et al. (2013b). Mit freundlicher Genehmigung von Springer Science+Business Media.
Abb. 6.3 Diagramm für den Arbeitsablauf bei Proteindetektionsmethoden. Modifiziert nach Griebel et al. (2013b). Mit freundlicher Genehmigung von Springer Science+Business Media.
Abb. 6.4 Differenzgelelektrophorese (DIGE): (a) Schematische Darstellung der Markierung von zwei Proben und eines Probengemisches, des internen Standards, mit drei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und der Auftrennung im selben 2-D-Elektrophoresegel. (b) Falschfarbendarstellung von Cy3- und Cy5-Bildkanälen nach dem Scannen und der Bildüberlagerung. Gelbe Spots: keine Veränderung; rote Spots: Hochregulierung; grüne Spots: Herunterregulierung; „gesund“ und „krank“ kann man durch „Kontrolle“ und „behandelt“ oder „Wildtyp“ und „Mutante“ ersetzen.
Abb. 6.5 Vergleichende Fluoreszenzgelelektrophorese in einem horizontalen Gel. (50 μg E. coli – rot, 0,72 μg Referenzgittermischung pro Slot – grün). Mit freundlicher Genehmigung von Hanneken und König (2014), IZKF Universität Münster.
Abb. 6.6 Färbekurve von Carboanhydrase, getrennt mit SDS-PAGE bei Kolloidalfärbung mit Coomassie Brilliant Blau G-250: Peakfläche/Proteinmenge.
Abb. 6.7 Scanner für Elektrophoresegele. (a) Desktop-A4-Scanner für sichtbare Färbungen mit Transmissions- und Reflexionsmessung, Bio5000 (SERVA). (b) Mehrzweckfluoreszenzscanner Typhoon (GE Healthcare) mit konfokaler Optik.
Abb. 6.8 CCD-Kamerasystem mit neuer Lichtdiffusionstechnologie für sichtbare Färbungen und UV-Belichtung, Chemilumineszenz und Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen, mit WiFi-Verbindung, SERVA Blue Imager.
Abb. 6.9 Computerbildschirm mit den Trennspuren eines SDS-Gels und ein Densitogramm einer ausgewählten Trennspur mit annotierten Molekulargewichten.
Abb. 6.10 Computerbildschirm einer 2-D-Auswertesoftware. Im Hintergrund: 2-D-Trennungen mit automatisch detektierten Spots. Im Vordergrund: Volumentabelle, Histogramme und dreidimensionale Darstellung von ausgewählten Spotgruppen.
Abb. 6.11 ScreenPicker für halbautomatisches Spotpicken von fluoreszenz- und anders gefärbten Gelen. Das 2-D-Muster wird mit einem Flachbildschirm unter das Gel projiziert, das auf einer Glasplatte liegt. Die Gelpfropfen werden mit einem manuellen Picker ausgestanzt und in die zugehörigen Positionen in der Mikrotiterplatte transferiert. RM: Referenzmarker.

7 Blotting

Abb. 7.1 Die wichtigsten Schritte beim Blotting aus Elektrophoresegelen.
Abb. 7.2 Bidirektioneller Transfer von Proteinen aus großporigen Gelen mit Diffusions-Blot-ting.
Abb. 7.3 Kapillar-Blotting, Transferdauer über Nacht.
Abb. 7.4 Press-Blotting eines foliengestützten Gels.
Abb. 7.5 Transfer von Nukleinsäuren mit Vakuum-Blotting in 30–40 min.
Abb. 7.6 Schematische Darstellung eines Tankblotters.
Abb. 7.7 Beispiele von Semidry-Blottern: (a) TE77XP (Hoefer) mit Gewicht; (b) Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) mit zwei Kassetten; (c) iBlot®(life technologies).
Abb. 7.8 Schematische Darstellung des Aufbaus eines horizontalen Grafitblotters für Semidry-Blotting; modifiziert nach Kyhse-Andersen (1984).
Abb. 7.9 Gerät zur zerstörungsfreien und vollständigen Abtrennung von foliengestützten Gelen für Blotting.
Abb. 7.10 Schematische Darstellung von Fluoreszenz-Blotting.
Abb. 7.11 Schematische Darstellung der Kombination der enzymatischen Chemilumineszenzdetektion mit Biotin-Streptavidin-Komplexen, welche die höchste Nachweisempfindlichkeit erreicht.
Abb. 7.12 Schematische Darstellung der Simple-Western-Methode (nach Protein Simple, San Jose, CA, USA).
Abb. 7.13 Methoden für Elektroelution von Proteinen ohne Dialysiermembran. (a) Das Gelstückchen wird in ein spezielles konisches Elutionsröhrchen platziert, das in ein Reaktionsgefäß eingesetzt wird. Das Ganze wird mit einer Elektrodenkappe verschlossen. (b) Elektroelution in einem diskontinuierlichen Leitfähigkeitsgradienten.

Methode 1: PAGE von Farbstoffen

Abb. M1.1 Herstellung des Slotformers.
Abb. M1.2 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M1.3 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M1.4 Gießen eines ultradünnen Polyacrylamidgels. Nachdem die vorberechnete Menge der Polymerisationslösung einpipettiert ist: Büroklammern herausziehen und Klammern ganz aufschieben.
Abb. M1.5 Tränken der Dochte in Elektrodenpuffer im PaperPool und Herausrollen von Luftblasen.
Abb. M1.6 Gel und Elektrodendochte für die Trennung von Farbstoffen. Probenauftrag in der Mitte. Beispiel einer Horizontalkammer: Multiphor II. Die gepunkteten Linien auf den Dochten zeigen die Elektrodenpositionen an.
Abb. M1.7 Ergebnis einer Ultradünnschichtelektrophorese von Farbstoffen, Anode oben.

Methode 2: Agarose- und Immunelektrophoresen

Abb. M2.1 Herstellung des Slotformers.
Abb. M2.2 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M2.3 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M2.4 Gießen der heißen Agaroselösung in die vorgewärmte Kassette.
Abb. M2.5 Lagerung des Agarosegels über Nacht in der Feuchtekammer.
Abb. M2.6 Großes Immunelektrophoresegel mit Grabar-Williams-Technik.
Abb. M2.7 Ausstanzen und Schneiden der Probenlöcher bzw. der Rinnen.
Abb. M2.8 Ausstanzen der Probenlöcher für Rocket-Technik.
Abb. M2.9 Abtrocknen der Geloberfläche mit Filterpapier.
Abb. M2.10 Agarosegelelektrophorese.
Abb. M2.11 Pressen des Agarosegels.

Methode 3: Titrationskurvenanalyse

Abb. M3.1 Schneiden der schmalen Klebebandstreifen zur Erzeugung von Probenrinnen im Gel.
Abb. M3.2 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M3.3 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M3.4 Einfüllen der Polymerisationslösung.
Abb. M3.5 Rehydratisieren eines Titrationskurvengels im GelPool.
Abb. M3.6 Platzierung des Titrationskurvengels auf die Kühlplatte zur Erzeugung des pH-Gradienten. Beispiel für eine Horizontalkammer: Blue Horizon.
Abb. M3.7 Schematische Darstellung eines Titrationskurvenergebnisses.

Methode 4: Native PAGE in amphoteren Puffern

Abb. M4.1 Elektrophorese von kationischen Farbstoffen in 0,5 mol/L HEPES, Methode 4a.
Abb. M4.2 Herstellung des Slotformers.
Abb. M4.3 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M4.4 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M4.5 Befüllen der Kassette mit den Polymerisationslösungen.
Abb. M4.6 Rehydratisieren eines Gels. (a) Einlegen des trockenen Gels in den GelPool. (b) Anheben der Folienkanten zur gleichmäßigen Verteilung der Flüssigkeit. (c) Rehydratisieren auf einem Orbitalschüttler (nicht zwingend notwendig). (d) Entfernung des überschüssigen Puffers mit einem Filterpapier.
Abb. M4.7 Tränken der Dochte in Elektrodenpuffer im PaperPool und Herausrollen von Luftblasen.
Abb. M4.8 Kationische Nativelektrophorese: Probenaufgabe an der Anode. Beispiel einer Horizontalkammer: Blue Horizon. Die gepunkteten Linien auf den Dochten zeigen die Elektrodenpositionen an.
Abb. M4.9 Kationische Nativelektrophorese in 0,6 mol/L HEPES von Markerproteinen und Fleischsäften. Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blau R-250 (Kathode oben).

Methode 5: Agarosegel-IEF

Abb. M5.1 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M5.2 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M5.3 Gießen der heißen Agaroselösung in die vorgewärmte Kassette.
Abb. M5.4 Agarosegel in der Feuchtekammer.
Abb. M5.5 Abtrocknen der Geloberfläche mit Filterpapier.
Abb. M5.6 Agarosegel-IEF mit Elektrodenstreifen und Probenaufgabeband.
Abb. M5.7 Pressen des Agarosegels.

Methode 6: PAGIEF in rehydratisierten Gelen

Abb. M6.1 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M6.2 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M6.3 Einfüllen der Polymerisationslösung.
Abb. M6.4 Rehydratisieren eines Gels. (a) Einlegen des trockenen Gels in den GelPool. (b) Anheben der Folienkanten zur gleichmäßigen Verteilung der Flüssigkeit. (c) Rehydratisieren auf einem Orbitalschüttler (nicht zwingend notwendig). (d) Trocknen der Oberfläche mit der Kante eines Filterpapiers.
Abb. M6.5 Bei gewaschenen IEF-Gelen werden die Fokussierungselektroden direkt auf die Gelkanten gelegt. Beispiel einer Horizontalkammer: Blue Horizon.
Abb. M6.6 Stufentest zur Ermittlung der optimalen Probenaufgabestelle.

Methode 7: Horizontale SDS-Polyacrylamidelektrophorese

Abb. M7.1 SDS-PAGE von fluoreszenzmarkierten Urinproteinen in einem Horizontalgel. (a) Fluoreszenzbild aufgenommen mit 4 s Anregung mit blauem LED im Serva BlueImager; Emissionsfilter für 595 nm Wellenlänge. (b) Silberfärbung desselben Gels. Vom Serva Entwicklungslabor mit freundlicher Genehmigung.
Abb. M7.2 Herstellung des Slotformers.
Abb. M7.3 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M7.4 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M7.5 Pipettieren der superschweren Monomerlösung für das Plateau.
Abb. M7.6 Gießen des linearen Gradienten.
Abb. M7.7 Tränken der Dochte in Elektrodenpuffer im PaperPool und Herausrollen von Luftblasen.
Abb. M7.8 Semidry-SDS-Elektrophorese: Probenaufgabe an der Kathode. Beispiel einer Horizontalkammer: Blue Horizon. Die gepunkteten Linien auf den Dochten zeigen die Elektrodenpositionen an.
Abb. M7.9 Vorrichtung zum Heißfärben.
Abb. M7.10 (a) SDS-Elektrophorese von Leguminosensamenextrakten und Molekulargewichtsmarkern in einem rehydratisierten Gel mit 5 % T Sammelgelzone und einer homogenen 10 % T Trenngelzone. (b) Trennung von Peptid- und Niedermolekulargewichts-markern in einem rehydratisierten 15 % T Gel mit 30 % (v/v) Monoethylenglycol und dem im Text beschriebenen Puffersystem. Färbung mit Coomassie Brilliant Blau R-350.

Methode 8: Vertikale PAGE

Abb. M8.1 Vertikale SDS-Elektrophorese von Leguminosensamenextrakten und Markerproteinen in einem Minigel, das mit der vereinfachten Methode hergestellt wurde; Silberfärbung.
Abb. M8.2 Gelkassette für ein vertikales Gel.
Abb. M8.3 Vorbereitung eines Gießstands für ein oder zwei Gelkassetten.
Abb. M8.4 Gießen eines Gradientengels.
Abb. M8.5 Zusammenbau der Gelkassetten im Mehrfachgelgießstand.
Abb. M8.6 Gießen von multiplen diskontinuierlichen Gelen.
Abb. M8.7 Gießen von multiplen Gradientengelen.
Abb. M8.8 Probenaufgabe auf Vertikalgel.
Abb. M8.9 SDS-PAGE von niedermolekularen Peptiden. Proben: Trennspuren 1 und 5: Molekulargewichtsmarker; 2,6 und 9: Peptidmarker 2,5–17 kDa; 3, 7 und 10: Insulin; 4 und 8: Aprotinin. Coomassie-Brilliant-Blau-Heißfärbung.
Abb. M8.10 Trocknen eines Polyacrylamidgels zwischen zwei nassen Cellophanfolien mit zwei Plastikrahmen. (a) Von unten nach oben: Ladeplattform – kleinerer Rahmen – Cellophan – Gel – Cellophan – großer Rahmen. (b) Die zwei Rahmen werden von der Plattform abgenommen, die Schrauben um 90° gedreht.

Methode 9: Blau-Nativ-PAGE

Abb. M9.1 Gießen eines Gradienten für ein Blau-Nativ-Gel von unten.
Abb. M9.2 Blau-Nativ-PAGE/SDS-PAGE von mitochondrialen Komplexen von Arabidopsis thaliana (Eubel et al., 2003). Die Komplexe wurden mit Digitonin solubilisiert. Sie sind mit römischen Ziffern beschriftet: I+III ist ein Superkomplex, der sich aus den Komplexen I und III zusammensetzt. Nachfärbung des SDS-Gels mit Coomassie Brilliant Blau.

Methode 10: Semidry-Blotting von Proteinen

Abb. M10.1 Einsetzen der anodischen Grafitplatte anstelle der Kühlplatte. Beispiel einer Horizontalkammer: Multiphor mit NovaBlot-Bloteinsatz.
Abb. M10.2 Maske.
Abb. M10.3 Aufbau des Blotstapels auf der anodischen Grafitplatte.
Abb. M10.4 Abschneiden der Trägerfolie und Übertragen des Trägerfoliengel-Nitrocellulose-membran-Stapels auf den Anodenpapierstapel.
Abb. M10.5 Auswalzen der Luftblasen.
Abb. M10.6 SDS-PAGE von Leguminosenextrakten. (a) Mit Indian Ink gefärbte Nitrocellulosemembran nach Blotting; (b) Coomassie-Blau-gefärbtes Gel – gleiche Proteinkonzentration.

Methode 11: IEF im immobilisierten pH-Gradienten

Abb. M11.1 Grafische Interpolation eines maßgeschneiderten immobilisierten pH-Gradienten pH 5,3–5,6. Ordinaten: Immobilinevolumen.
Abb. M11.2 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M11.3 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M11.4 Gießen des linearen pH-Gradienten.
Abb. M11.5 Rehydratisieren eines IPG-Gels in: (a) einer vertikalen Kassette oder (b) einer Rehydratisierwanne (Gelpool).
Abb. M11.6 Rehydratisieren in einem Additivgradienten.
Abb. M11.7 Auflegen des Immobilinegels auf die Kühlplatte der Elektrophoresekammer. Beispiel einer Horizontalkammer: Blue Horizon.
Abb. M11.8 Verschiedene Möglichkeiten der Probenaufgabe bei IPG-Gelen: (1) Tröpfchen, (2) Zellulosestückchen, (3) Probenaufgabeband, (4) abgeschnittener Silikonschlauch.
Abb. M11.9 Strategien der IPG-Fokussierung.

Methode 12: Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese

Abb. M12.1 Zwei 2-D-Trennungen derselben Probe mit Rehydratisierbeladung: (a) unbearbeitete Probe; (b) nach Präzipitation. Silberfärbung.
Abb. M12.2 Gießen eines IPG-Gels für lange Trenndistanzen.
Abb. M12.3 Präzises Schneiden der trockenen IPG-Streifen mit einem Rotationspapierschnei-der.
Abb. M12.4 Rehydratisierwanne für das Anquellen von IPG-Streifen in Rinnen: entweder in Rehydratisierlösung (für Cup-Loading) oder in der Probenlösung (Rehydratisierbeladung).
Abb. M12.5 IEF in individuellen IPG-Streifen direkt auf der Kühlplatte. Die offenen Geloberflächen werden mit Parafilm® abgedeckt. Beispiel für eine Horizontalkammer: Blue Horizon.
Abb. M12.6 IEF in individuellen IPG-Streifen im IPG-Streifen-Kit, einem Zubehör der Multiphor-Kammer.
Abb. M12.7 Rehydratisierbeladung in individuellen Keramikschiffchen. (a) Pipettieren des Probenrehydratisierlösunggemisches in das Schiffchen; (b) Einlegen des IPG-Streifens mit der trocknen Gelseite nach unten auf die Flüs-sigkeit; (c) Pipettieren von ein paar Millilitern Paraffinöl auf die Trägerfolie des IPG-Streifens; (d) Abdecken des Schiffchens mit dem Deckel. Diese Keramikschiffchen sind Zubehör der IPGphor.
Abb. M12.8 Wanne für Cup-Loading und die IPG-IEF mit der Geloberfläche nach oben. Diese Wanne ist ein Zubehör für die IPGphor.
Abb. M12.9 Probenauftrageplättchen mit Markerproteinen werden auf die Gelkante aufgesetzt, dann erfolgt das Pipettieren der Agaroselösung und Einsetzen des IPG-Streifens in die SDS-Gelkassette.
Abb. M12.10 Erzeugung einer gleichmäßigen Schicht von Kühlkontaktflüssigkeit auf der Kühlplatte.
Abb. M12.11 Tränken der Dochte in Elektrodenpuffer im PaperPool und herausrollen von Luftblasen.
Abb. M12.12 Auflegen von zwei äquilibrierten IPG-Streifen auf ein SDS-Gel mit Standardgröße. Beispiel einer Horizontalkammer: Multiphor mit kontinuierlich variablen Elektrodenpositionen. Die gepunkteten Linien auf den Dochten zeigen die Elektrodenpositionen an.
Abb. M12.13 Auflegen von einem äquilibrierten langen IPG-Streifen auf ein SDS-Large-Scale-Gel. Die Gelfläche hat die Größe der Kühlplatte. Elektrodendochte in 2,5 cm breite Streifen schneiden, Stapel von je zwei Streifen auf beiden Gelseiten verwenden. Beispiel einer Horizontalkammer: Multiphor mit kontinuierlich variablen Elektrodenpositionen. Die gepunkteten Linien auf den Dochten zeigen die Elektrodenpositionen an.
Abb. M12.14 Ausrüstung für HPE™-Fertiggele: (a) Einzelkammer Blue Horizon; (b) Mehrfachkammer Blue Tower für bis zu vier Gele. Die Elektroden können auf drei unterschiedliche Distanzen versetzt werden.
Abb. M12.15 Kunststoffbox mit fünf Wannen zum Färben von großen Gelen.
Abb. M12.16 Zweidimensional-Elektrophorese von 150 μg E. coli Extrakt. IEF im 24 cm IPG-Streifen pH 4–7, Cup-Loading am anodischen Ende. SDS-PAGE im 0,65 mm dünnen homogenen Polyacrylamidgel mit 12,5 % T auf nicht-fluoreszierender Trägerfolie. Fluoreszenzfärbung mit ServaPurple. Gescanned mit Typhoon Multifluoreszenzimager mit einem grünen Laser bei 532 nm, Emissionsfilter 610 nm Bandpass 30.

Methode 14: PAGE von DNA-Fragmenten

Abb. M14.1 Herstellung eines Slotformers für kurze (a) und lange (b) Trenndistanzen.
Abb. M14.2 Aufwalzen der Trägerfolie.
Abb. M14.3 Zusammenbau der Gießkassette.
Abb. M14.4 Befüllen der Kassetten mit den Polymerisationslösungen.
Abb. M14.5 Rehydratisieren eines Gels. (a) Einlegen des trockenen Gels in den GelPool. (b) Anheben der Folienkanten zur gleichmäßigen Verteilung der Flüssigkeit. (c) Rehy-dratisieren auf einem Orbitalschüttler (nicht zwingend notwendig). (d) Entfernung des überschüssigen Puffers mit einem Filterpapier.
Abb. M14.6 Tränken der Dochte in Elektrodenpuffer im PaperPool und Herausrollen von Luftblasen.
Abb. M14.7 Trennung von DNA-Fragmenten in kurzen und langen Trenndistanzen. Probenaufgabe an der Kathode. Beispiel einer Horizontalkammer: Multiphor. Die gepunkteten Linien auf den Dochten zeigen die Elektrodenpositionen an.
Abb. M14.8 Trennung von DNA-Fragmenten in einem rehydratisierten Polyacrylamidgel mit diskontinuierlichem Puffersystem. Silberfärbung.

2. Auflage 2016

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Geleitwort

Die Anzahl der elektrophoretischen Trennmethoden hat seit Tiselius’ grundlegenden Arbeiten, die mit einem Nobelpreis ausgezeichnet wurden, drastisch zugenommen. Der Weg von der Papier-, Celluloseacetat- und Stärkegelelektrophorese über die Molekularsieb-, Disk-, SDS- und Immunelektrophorese bis hin zur Isoelektrischen Fokussierung einschließlich der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese hat zusammen mit der Silber- und Goldfärbung, der Autoradiografie, Fluorografie und den Blottingverfahren zu immer höherer Auflösung, Nachweisempfindlichkeit und Spezifität in der Proteinanalytik geführt. Des Weiteren hat sich die Gelelektrophorese als einzigartiges Werkzeug für die DNA-Sequenzierung erwiesen, während die hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese den faszinierenden Weg vom isolierten Protein über die Aminosäurensequenzanalyse zum Gen und nach dessen Klonierung zur Proteinsynthese geebnet hat.

Das Spektrum des Analysenmöglichkeiten ist somit immer vielfältiger geworden, sodass eine zusammenfassende Darstellung der elektrophoretischen Trennmethoden nicht nur für den Anfänger, sondern auch für den erfahrenen Praktiker wünschenswert erscheint. Mit dieser Zielsetzung ist dieses Buch geschrieben worden.

Der Autor gehört zum Kreis der Bluefingers und hat dies 1979 in Mailand hautnah erfahren müssen, als er nach getaner Laborarbeit in einem Zigarettenkiosk aufgrund der Coomassie-gefärbten Hände in den Verdacht des Geldfälschens geriet, und Prof. P.G. Righetti und ich ihn aus einer bedrohlichen Situation befreien mussten. Somit ist bei diesem Buch gemäß Maurers Definition (Proceedings of the first small conference of the bluefingers, Tübingen 1972) ein Experte am Werk gewesen, der den Weißfingern, die die Methoden nur vom Hörensagen kennen, erzählen kann, wie sie z. B. keine blauen Finger bekommen.

Wie dem auch sei, ich bin sicher, dass die zusammenfassende Darstellung der Methoden nicht nur die Weißfinger, sondern auch die Gemeinschaft der Bluefingers, Silverfingers, Goldfingers usw. erfreuen und mit vielen technischen Details bereichern wird.

Weihenstephan, im Februar 1990

Priv.-Doz. Dr. Angelika Görg

Vorwort

25 Jahre nach dem Erscheinen des „Elektrophorese-Praktikums“ und nach vier Auflagen der englischen Version „Electrophoresis in Practice“ gibt es wieder eine deutschsprachige Version mit dem neuen Namen „Elektrophorese leicht gemacht“. Der Titel deutet an, dass auch dieser Band keine tiefgründige theoretische Ableitungen und Erklärungen der Methoden und Phänomene enthält. Der erste Teil soll einen Überblick über die diversen Techniken nach neuestem Stand vermitteln und konzentriert sich auf Hinweise zur praktischen Durchführung von Elektrophoreseexperimenten. Im zweiten Teil findet man praktische Anleitungen zu 14 Methoden und Problemlösungen, die aufgrund der Erfahrungen im täglichen Geschäft eines „Produktspezialisten für Elektrophorese“ bei verschiedenen Technologieanbietern nochmals deutlich erweitert wurden.

Freising, im Juli 2016

R. Westermeier

Vorwort zur ersten Auflage

Dieses Buch ist für die Praktiker im Elektrophoreselabor verfasst worden. Auf physikochemische Ableitungen und Formeln elektrophoretischer Phänomene wurde deshalb verzichtet.

Die Art und Weise der Erklärungen und die Darstellungsform hat sich aus der jahrelangen Erfahrung bei Anwenderseminaren und -kursen, Abfassung von Bedienungsanleitungen und Lösungen von Anwendungsproblemen ergeben. Sie sollten für technische Assistenten ebenso verständlich sein wie für in der Forschung stehende Wissenschaftler.

In Teil I wird so knapp wie möglich – eine Übersicht über den Stand der Technik in der Elektrophorese – gegeben. Die Literaturzitate erheben keinen Anspruch auf Vollständigkeit.

Der Teil II enthält exakte Arbeitsanleitungen für 12 ausgewählte Elektrophoresemethoden, die mit einer apparativen Ausrüstung durchgeführt werden können. Die Reihenfolge der Methoden wurde in der Weise festgelegt, dass man danach einen Elektrophoresekurs für Anfänger und Fortgeschrittene zusammenstellen kann. Mit diesen Methoden ist der Hauptteil der für das biologische, biochemische, medizinische und lebensmittelchemische Labor notwendigen Techniken abgedeckt.

Sollten – trotz exakten Nacharbeitens der Methodenbeschreibungen – unerklärliche Effekte auftreten, kann man deren Gründe und die zu ihrer Vermeidung notwendigen Maßnahmen im Anhang unter der Rubrik „Problemlösungen“ finden.

Für zusätzliche Hinweise und Problemlösungen aus der Leserschaft ist der Autor dankbar.

Freiburg, im März 1990

R. Westermeier

Abkürzungen

A	Ampere
A, C, G, T	Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin
ACES	N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure
AEBSF	Aminoethylbenzylsulfonylfluorid
APS	Ammoniumpersulfat
AU	Absorptionseinheiten (units)
16-BAC	Benzyldimethyl-n-hexadecylammoniumchlorid
BAC	Bisacryloylcystamin
Bis	N, N^′-Methylenbisacrylamid
BNE	Blau-Nativ-Elektrophorese
bp	Basenpaar
BSA	Rinderserumalbumin
C	Vernetzungsgrad (Crosslinking) (%)
CAPS	3-(Cyclohexylamino)propansulfonsäure
CCD	charge-coupled device
CHAPS	3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propansulfat
CM	Carboxymethyl
CoFGE	Komparative (vergleichende) Fluoreszenzgelelektrophorese
const.	konstant
CTAB	Cetyl-trimethylammoniumbromid
Da	Dalton
DBM	Diazobenzyloxymethyl
DEA	Diethanolamin
DEAE	Diethylaminoethyl
DIGE	Differenzgelelektrophorese
Disk	diskontinuierlich
DMF	Dimethylformamid
DMSO	Dimethylsulfoxid
DNA	Desoxyribonukleinsäure
DPT	Diazophenylthioether
dsDNA	Doppelstrang-DNA
DTE	Dithioerythritol
DTT	Dithiothreitol
E	Feldstärke, angegeben in V/cm
EDTA	Ethylendinitrilotetraessigsäure
EEO	Elektroendosmose
EPO	Erythropoietin
ESI	Elektrospray-Ionisation
g/v	Gewicht pro Volumen (Massenkonzentration)
GC	gruppenspezifische Komponente
GLP	Gute Laborpraxis
GMP	Gute Herstellungs (Manufacturing)-Praxis
h	Stunden
HED	Hydroxyethyldisulfid
HEPES	N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N^′-2-ethansulfonsäure
HMW	high molecular weight
HPCE	High Performance Capillary Electrophoresis
HPLC	High Performance Liquid Chromatography
I	Stromstärke, angegeben in A, mA
IEF	Isoelektrische Fokussierung
IgG	Immunglobulin G
IPG	Immobilisierte pH-Gradienten
ITP	Isotachophorese
kb	Kilobasen
kDa	Kilodalton
konz.	konzentriert
K_R	Retardationskoeffizient
LED	light-emitting diode
LIF	Laserinduzierte Fluoreszenz
LMW	low molecular weight
mA	Milliampere
MALDI	Matrix-assistierte Laserdesorptionsionisierung
MCE	Mikrochipelektrophorese
MEKC	Mizellare elektrokinetische Chromatografie
MES	Morpholinoethansulfonsäure
MG	Molekulargewicht
min	Minute
mol/L	Einheit der Molarität
MOPS	Morpholinopropansulfonsäure
m_r	relative elektrophoretische Mobilität
MS	Massenspektrometrie
Msⁿ	Massenspektrometrie mit n Massenanalyse-Experimenten
MS/MS	Tandem-Massenspektrometrie
MW	Molekulargewicht
NAP	nucleic acid purifier
Nonidet	nicht ionisches Detergens
NEPHGE	Non-Equilibrium pH-Gradient Elektrophoresis
NHS	N-Hydroxy-Succinimid
O.D.	optische Dichte
P	Leistung (power) angegeben in W
PAG	Polyacrylamidgel
PAGE	Polyacrylamidgelelektrophorese
PAGIEF	Polyacrylamidgel-Isoelektrische-Fokussierung
PBS	phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PC	Personal Computer
PCR	Polymerasekettenreaktion
PEG	Polyethylenglycol
PFG	Pulsed Field Gel(-Elektrophorese)
PGM	Phosphoglucomutase
pI	isoelektrischer Punkt
PI	Proteaseinhibitor
pK-Wert	Dissoziationskonstante
PMSF	Phenylmethylsulfonylfluorid
PPA	Piperidinopropionamid
PVC	Polyvinylchlorid
PVDF	Polyvinylidendifluorid
r	Molekülradius
RAPD	Random Amplified Polymorphic DNA
Rf-Wert	relative Laufstrecke
RFLP	Restriktions-Fragmente-Längen-Polymorphismus
R_m	relative elektrophoretische Mobilität
RNA	Ribonukleinsäure
RT	Raumteil (Volumenanteil)
RuBP	Ruthenium-II-tris-bathophenantrolindisulfonat
s	Sekunde
SDS	Natrium (sodium) dodecylsulfat
SNP	single nucleotid polymorphism
SSCP	Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (single strand conformation polymorphism)
ssDNA	single strand (Einzelstrang) DNA
T	Totalacrylamidkonzentration (%)
t	Zeit (time), angegeben in h, min, s
TBE	Tris-Borat-EDTA
TBP	Tributylphosphin
TBS	Tris-gepufferte Salzlösung (Tris-buffered saline)
TCA	Trichloressigsäure (acid)
TCEP	Tris(2-carboxyethyl)phosphine
TEMED	N, N, N^′, N^′-Tetramethylethylendiamin
TF	Transferrin
ToF	Time of Flight (Flugzeit)
Tricin	N-Tris(hydroxymethyl)-methylglycin
Tris	Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U	Spannung, angegeben in V
UpM	Umdrehungen pro Minute
UV	ultraviolettes Licht
V	Volt
V	Volumen, angegeben in L
v	Wanderungsgeschwindigkeit, angegeben in m/s
v/v	Volumen pro Volumen (Volumenanteil)
W	Watt
WiFi	Wireless Local Area Network (Kunstwort)
ZE	Zonenelektrophorese

Ein Praxisbuch für Anwender

Geleitwort

Vorwort

Vorwort zur ersten Auflage

Abkürzungen