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Elektrophorese leicht gemacht


Elektrophorese leicht gemacht

Ein Praxisbuch für Anwender
2. Auflage

von: Reiner Westermeier

79,99 €

Verlag: Wiley-VCH
Format: EPUB
Veröffentl.: 26.09.2016
ISBN/EAN: 9783527695140
Sprache: deutsch
Anzahl Seiten: 474

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Beschreibungen

Die zweite Auflage eines Standardwerks: Alle wichtigen Aspekte und Techniken der Elektrophorese werden abgedeckt, von SDS-PAGE und Isotachophorese bis zu isoelektrischer Fokussierung, blauer Nativ-Elektrophorese und zweidimensionalen Methoden. Speziell auf die Bedürfnisse von Laboranten und technischen Angestellten zugeschnitten, stehen praktische Gesichtspunkte und Methoden im Mittelpunkt des Buchs. Nach einem Überblick über alle gängigen Elektrophoresetechniken mit einer Einführung in Detektion, Musterauswertung und Proteomik folgen Kapitel zu Instrumentierung und benötigten Arbeitsmaterialien. Detaillierte Methodenanleitungen erleichtern auch dem Anfänger den praktischen Einstieg in die Welt der Elektrophorese. Die Begleitwebsite mit zahlreichen Animationen ermöglicht einen zusätzlichen visuellen Zugang zu den einzelnen Techniken.
Geleitwort XV Vorwort XVII Vorwort zur ersten Auflage XIX Abkürzungen XXI Teil I Grundlagen 1 1 Elektrophorese 7 1.1 Allgemeines 7 1.1.1 Elektrophoresen in freier Lösung 7 1.1.2 Elektrophoresen in stabilisierenden Medien 11 1.1.3 Gelelektrophorese 12 1.1.4 Stromversorger 20 1.1.5 Trennkammern 20 1.2 Elektrophoresen in nicht restriktiven Gelen 25 1.2.1 Agarosegelelektrophorese 25 1.2.2 Polyacrylamidgelelektrophorese von niedermolekularen Substanzen 27 1.3 Elektrophorese in restriktiven Gelen 28 1.3.1 Der Ferguson-Plot 28 1.3.2 Agarosegelelektrophorese 29 1.3.3 Polyacrylamidgelelektrophorese von Nukleinsäuren 31 1.3.4 Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen 34 Literatur 48 2 Isotachophorese 53 2.1 Wanderung mit gleicher Geschwindigkeit 55 2.2 Trennung der Substanzen in der Form einer Kette ion train 55 2.3 Zonenschärfungseffekt 55 2.4 Konzentrationsregulierungseffekt 56 Literatur 57 3 Isoelektrische Fokussierung 59 3.1 Prinzip 59 3.2 Gele für die IEF 61 3.2.1 Polyacrylamidgele 61 3.2.2 Agarosegele 63 3.3 Temperatur 64 3.4 Kontrolle des pH-Gradienten 64 3.5 Arten von pH-Gradienten 65 3.5.1 Freie Trägerampholyten 65 3.5.2 Immobilisierte pH-Gradienten 69 3.6 Präparative Isoelektrische Fokussierung 72 3.7 Titrationskurvenanalyse 73 Literatur 75 4 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese 79 4.1 IEF in IPG-Streifen 79 4.1.1 Streifengeometrie 80 4.1.2 pH-Gradienten 80 4.1.3 Einfluss von Salzen 80 4.1.4 Basische pH-Gradienten 81 4.1.5 Rehydratisieren von IPG-Streifen 82 4.1.6 Probenaufgabe 85 4.1.7 IEF-Bedingungen 87 4.1.8 Instrumentierung 88 4.2 SDS-PAGE 90 4.2.1 Äquilibrieren der IPG-Streifen 90 4.2.2 TechnischeKonzepte für die zweite Dimension (SDS-PAGE) 91 4.2.3 Geltypen 93 4.2.4 Gelherstellung 94 4.2.5 Durchführung der SDS-Elektrophorese 97 4.3 Proteomik 99 Literatur 99 5 Proteinprobenvorbereitung 103 5.1 Proteinquantifizierungsmethoden 103 5.2 Vorbereitung von nativen Proben 104 5.3 Proben für die SDS-Elektrophorese 105 5.3.1 SDS-Behandlung 105 5.3.2 Aufreinigung und Proteinanreicherung 109 5.4 Proben für die hochauflösende 2-D-PAGE 110 5.4.1 Waschen von Zellen 111 5.4.2 Zellaufschluss 111 Inhaltsverzeichnis VII 5.4.3 Probennahme und -aufbewahrung 112 5.4.4 Inaktivierung von Proteasen 114 5.4.5 Inaktivierung von Phosphatasen 114 5.4.6 Alkalische Bedingungen 114 5.4.7 Entfernung von störenden Substanzen 115 5.4.8 Vorfraktionierung 116 5.4.9 Spezialfall: Pflanzenproteine 117 Literatur 118 6 Proteindetektion 121 6.1 Fixierung 121 6.1.1 IEF-Gele 121 6.1.2 Agarosegele 122 6.1.3 SDS-Polyacrylamidgele 122 6.2 Färbungen nach der Elektrophorese 122 6.2.1 Organische Farbstoffe 122 6.2.2 Silberfärbung 123 6.2.3 Negativfärbung 125 6.2.4 Fluoreszenzfärbung 126 6.2.5 Spezifische Detektion 127 6.2.6 Visualisierung ohne Färbung 128 6.3 Proteinmarkierung 129 6.3.1 Proteinmarkierung mit Fluorophoren 129 6.3.2 Radioaktive Markierung von lebenden Zellen 130 6.4 Differenzgelelektrophorese (DIGE) 130 6.4.1 Minimal-Lysinmarkierung 131 6.4.2 Sättigung-Cysteinmarkierung 133 6.4.3 Der interne Standard 134 6.4.4 Planung eines Experiments 134 6.4.5 Die wichtigsten Vorteile von 2-D-DIGE 134 6.4.6 Vergleichende Fluoreszenzgelelektrophorese 135 6.5 Bildaufzeichnung, Bildanalyse, Spotpicken 136 6.5.1 Gehaltsbestimmungen 136 6.5.2 Bildaufzeichnungssysteme 138 6.5.3 Bildanalyse 141 6.5.4 Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen 144 Literatur 146 7 Blotting 151 7.1 Transfermethoden 151 7.1.1 Diffusions-Blotting 151 7.1.2 Kapillar-Blotting 152 7.1.3 Press-Blotting 153 7.1.4 Vakuum-Blotting 153 7.1.5 Elektrophoretisches Blotting 154 7.2 Blotmembranen 157 7.3 Puffer für elektrophoretische Transfers 158 7.3.1 Proteine 158 7.3.2 Nukleinsäuren 160 7.4 Allgemeine Anfärbung 160 7.5 Blockieren 161 7.6 Spezialdetektion 161 7.6.1 Hybridisierung 161 7.6.2 Enzym-Blotting 162 7.6.3 Immun-Blotting 162 7.6.4 Lektin-Blotting 165 7.6.5 Stripping,Mehrfachanalyse 166 7.6.6 Doppel-Blotting 166 7.7 Proteinsequenzierung 166 7.8 Transferprobleme 166 7.9 Elektroelution von Proteinen aus Gelen 167 Literatur 169 Teil II Praktische Methodenanleitungen – Ausrüstung und Methoden 173 Methode 1 PAGE von Farbstoffen 183 M1.1 Probenvorbereitung 183 M1.2 Stammlösungen 183 M1.3 Vorbereitung der Gießkassette 184 M1.3.1 Dichtung 184 M1.3.2 Slotformer 184 M1.3.3 Zusammenbau der Gießkassette 185 M1.4 Gießen der ultradünnen Gele 187 M1.5 Elektrophoretische Trennung 187 M1.5.1 Entnahme des Gels aus der Kassette 187 Methode 2 Agarose- und Immunelektrophoresen 191 M2.1 Probenvorbereitung 191 M2.2 Stammlösungen 192 M2.3 Herstellung der Gele 192 M2.3.1 Agarosegelelektrophorese 192 M2.3.2 Immunelektrophoresegele 194 M2.4 Elektrophoresen 198 M2.4.1 Grabar-Williams-Technik 199 M2.4.2 Laurell-Technik 199 M2.5 Proteinnachweis 200 M2.5.1 Coomassie-Färbung (Agaroseelektrophorese) 200 M2.5.2 Immunfixation der Agaroseelektrophorese 200 M2.5.3 Coomassie-Färbung (Immunelektrophoresen) 201 M2.5.4 Silberfärbung 202 Literatur 202 Methode 3 Titrationskurvenanalyse 203 M3.1 Probenvorbereitung 203 M3.2 Stammlösungen 203 M3.3 Herstellung der leeren Gele 204 M3.3.1 Vorbereitung der Gießform 204 M3.3.2 Zusammenbau der Gelkassette 205 M3.3.3 Befüllen der Gelgießkassette 207 M3.3.4 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 207 M3.4 Titrationskurvenelektrophorese 209 M3.4.1 Erzeugung des pH-Gradienten (Lauf ohne Probe) 209 M3.4.2 Nativelektrophorese im pH-Spektrum 210 M3.5 Coomassie- und Silberfärbung 210 M3.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 210 M3.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 211 M3.5.3 Fünf-Minuten-Silberfärbung getrockneter Gele 211 M3.6 Interpretation der Kurven 212 Literatur 214 Methode 4 Native PAGE in amphoteren Puffern 215 M4.1 Probenvorbereitung 216 M4.2 Stammlösungen 217 M4.3 Herstellung der leeren Gele 218 M4.3.1 Slotformer 218 M4.3.2 Zusammenbau der Gießkassette 219 M4.3.3 Polymerisationslösungen 220 M4.3.4 Befüllen der gekühlten Gelgießkassette 221 M4.3.5 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 221 M4.3.6 Waschen und Trocknen der Gele 222 M4.3.7 Quellen des Gels im amphoteren Puffer 222 M4.4 Elektrophorese 224 M4.5 Coomassie- und Silberfärbung 226 M4.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 226 M4.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 227 M4.5.3 Fünf-Minuten Silberfärbung getrockneter Gele 227 Literatur 228 Methode 5 Agarosegel-IEF 231 M5.1 Probenvorbereitung 231 M5.2 Herstellung des Agarosegels 232 M5.2.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 232 M5.2.2 Zusammenbau der Gelkassette 232 M5.2.3 Herstellung der Agaroselösung (0,8% Agarose) 233 M5.3 Isoelektrische Fokussierung 235 M5.3.1 Herstellung der Elektrodenlösungen 235 M5.4 Proteinnachweis 237 M5.4.1 Coomassie-Blau-Färbung 237 M5.4.2 Immunfixation 237 M5.4.3 Silberfärbung 238 Literatur 239 Methode 6 PAGIEF in rehydratisierten Gelen 241 M6.1 Probenvorbereitung 241 M6.2 Stammlösungen 241 M6.3 Herstellung der leeren Gele 242 M6.3.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 242 M6.3.2 Zusammenbau der Gelkassette 242 M6.3.3 Befüllen der Gelgießkassette 243 M6.3.4 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 244 M6.3.5 Waschen des Gels 244 M6.3.6 Trocknen des Gels 245 M6.4 Isoelektrische Fokussierung 245 M6.4.1 Rehydratisierlösung (Servalyt™, Pharmalyte™) 245 M6.4.2 Quellen des Gels 245 M6.4.3 Proteintrennung 246 M6.4.4 Probenaufgabe 247 M6.5 Coomassie- und Silberfärbung 248 M6.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 248 M6.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 249 M6.5.3 Die empfindlichste Silberfärbung für die IEF 249 M6.6 Methodischer Ausblick 251 Literatur 253 Methode 7 Horizontale SDS-Polyacrylamidelektrophorese 255 M7.1 Probenvorbereitung 255 M7.1.1 Nicht reduzierende SDS-Behandlung 255 M7.1.2 Reduzierende SDS-Behandlung 256 M7.1.3 Reduzierende SDS-Behandlungmit Alkylierung 257 M7.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 257 M7.2.1 Markierung 257 M7.2.2 Detektion 258 M7.3 Stammlösungen für die Gelherstellung 258 M7.4 Vorbereitung der Gießkassette 259 M7.4.1 Herstellen des Slotformers 259 M7.4.2 Zusammenbau der Gießkassette 260 M7.5 Gradienten-Gel 261 M7.5.1 Gießen des Gradientengels 261 M7.6 Elektrophorese 265 M7.6.1 Vorbereitung der Trennkammer 265 M7.6.2 Entnahme des Gels aus der Kassette 265 M7.6.3 Platzierung auf der Kühlplatte 265 M7.6.4 Elektrophorese 267 M7.7 Coomassie- und Silberfärbung 267 M7.7.1 Heiße Coomassie-Färbung 267 M7.7.2 Kolloidalfärbung 268 M7.7.3 Reversible Imidazol-Zink-Negativfärbung 269 M7.7.4 Silberfärbung 270 M7.7.5 Fluoreszenzfärbung mit SERVA Purple 270 M7.8 Blotting 271 M7.9 Methodischer Ausblick 272 M7.9.1 SDS-Elektrophorese in gewaschenen und rehydratisierten Gelen 272 M7.9.2 Trennung von Peptiden 273 Literatur 274 Methode 8 Vertikale PAGE 275 M8.1 Probenvorbereitung und Proteinmarkierung 276 M8.2 Stammlösungen für die SDS-PAGE 277 M8.3 Gießen von Einzelgelen 278 M8.3.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele 278 M8.3.2 Gradientengele 279 M8.4 Gießen vonMehrfachgelen 281 M8.4.1 Multiple diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele 282 M8.4.2 Multiple SDS-Polyacrylamidgradientengele 283 M8.5 Elektrophorese 286 M8.6 SDS-Elektrophorese von niedermolekularen Peptiden 288 M8.6.1 Stammlösungen 288 M8.7 Zweidimensional-Elektrophorese 289 M8.8 DNA-Elektrophorese 290 M8.9 Langzeitstabile Gele 291 M8.10 Proteindetektion 291 M8.11 Präparieren von Glasplatten mit Bind-Silan 292 M8.11.1 Beschichten einer Glasplatte mit Bind-Silan 292 M8.11.2 Entfernen von Gel und Bind-Silan von einer Glasplatte 293 Literatur 293 Methode 9 Blau-Nativ-PAGE 295 M9.1 Solubilisierung 295 M9.2 Stammlösungen 296 M9.3 Gießen der Gele 297 M9.4 Elektrophorese 299 Literatur 300 Methode 10 Semidry-Blotting von Proteinen 301 M10.1 Transferpuffer 303 M10.1.1 Kontinuierliches Puffersystem 303 M10.1.2 Diskontinuierliches Puffersystem 303 M10.1.3 Transfers aus Agarosegelen 304 M10.2 Technische Durchführung 304 M10.2.1 Gele ohne Trägerfolie 305 M10.2.2 Trägerfoliengebundene Gele 306 M10.2.3 Bei Verwendung von Nitrocellulose (NC)-Membran 306 M10.2.4 Bei Verwendung einer PVDF-Membran 307 M10.2.5 Proteintransfer aus den abgeschnittenen Gelen 308 M10.3 Färbung von Blotfolien 309 M10.3.1 Amidoschwarzfärbung 309 M10.3.2 Reversible Färbung 309 M10.3.3 Indian-Ink-Färbung 310 Literatur 311 Methode 11 IEF im immobilisierten pH-Gradienten 313 M11.1 Probenvorbereitung 314 M11.2 Stammlösungen 314 M11.3 Immobilinerezepturen 315 M11.3.1 Maßgeschneiderte pH-Gradienten 315 M11.4 Vorbereitung der Gießkassette 318 M11.4.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 318 M11.4.2 Zusammenbau der Gelkassette 319 M11.5 Herstellung der pH-Gradientengele 320 M11.5.1 Gießen des Gradienten 321 M11.6 Isoelektrische Fokussierung 327 M11.6.1 Probenaufgabe 327 M11.6.2 Elektrodenlösungen 328 M11.6.3 Fokussierungsbedingungen 328 M11.6.4 Messung des pH-Gradienten 329 M11.7 Coomassie- und Silberfärbung 329 M11.7.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 329 M11.7.2 Acid-Violet-17-Färbung 330 M11.8 Strategien der IPG-Fokussierung 331 Literatur 332 Methode 12 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese 333 M12.1 Probenvorbereitung 334 M12.1.1 Probenaufreinigung 335 M12.1.2 Wichtige Hinweise zur kompletten Resolubilisierung der Pellets 335 M12.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 338 M12.2.1 Markierung einer Probe 338 M12.2.2 Detektion 338 M12.3 Stammlösungen für die Gelherstellung 339 M12.4 Gelherstellung 340 M12.4.1 IPG-Streifen 340 M12.5 SDS-Porengradientengele 344 M12.6 Trennbedingungen 346 M12.6.1 Erste Dimension (IPG-IEF) 346 M12.6.2 Äquilibrieren 351 M12.6.3 Zweite Dimension (SDS-Elektrophorese) 352 M12.7 Proteindetektion 356 M12.7.1 Färben von multiplen Gelen 356 M12.7.2 Kolloidalfärbung 358 M12.7.3 Reversible Imidazol-Zink-Negativfärbung 358 M12.7.4 Silberfärbung 359 M12.7.5 Fluoreszenzfärbung mit SERVA Purple 360 Literatur 361 Methode 13 Zweidimensional-Differenzgelelektrophorese (DIGE) 365 M13.1 Planung eines Experiments 365 M13.2 Probenvorbereitung 366 M13.2.1 Solubilisierung von DIGE-Proben 366 M13.2.2 Rekonstituierung der CyDyes 367 M13.2.3 Für Minimalmarkierung der Lysine 367 M13.2.4 Für Sättigungsmarkierung der Cysteine 368 M13.3 DIGE-Markierung 368 M13.3.1 Minimalmarkierung der Lysine 368 M13.3.2 Sättigungsmarkierung der Cysteine 369 M13.4 Vorbereitung für die Probenaufgabe auf die IPG-Streifen 371 M13.5 Detektion der DIGE-Spots 371 Literatur 372 Methode 14 PAGE von DNA-Fragmenten 373 M14.1 Stammlösungen 374 M14.1.1 Puffersystem I (Tris-Acetat/Tris-Tricin) 374 M14.1.2 Puffersystem II (Tris-Phosphat/TBE) 375 M14.2 Herstellung der Gele 375 M14.2.1 Vorbereitung der Gießkassette 375 M14.2.2 Herstellen des Slotformers 376 M14.2.3 Zusammenbau der Gießkassette 377 M14.2.4 Befüllen der Gelgießkassetten 378 M14.2.5 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 379 M14.2.6 Waschen und Trocknen der Gele 379 M14.3 Probenvorbereitung 379 M14.3.1 PCR-Produkte generell 379 M14.3.2 SSCP-Proben 380 M14.4 Elektrophorese 381 M14.4.1 Anquellen von gewaschenen und getrockneten Gelen 381 M14.4.2 Vorbereitung der Elektrodendochte 383 M14.4.3 Entnahme des Gels aus der Kassette 383 M14.4.4 Platzierung auf der Kühlplatte 384 M14.4.5 Probenaufgabe und Elektrophorese 385 M14.5 Silberfärbung 386 Anhang A Problemlösungen 389 A.1 Häufige Fehler 389 A.2 Isoelektrische Fokussierung 392 A.2.1 PAGIEF mit Trägerampholyten 392 A.2.2 Agarosegel-IEF mit Trägerampholyten 401 A.2.3 Immobilisierte pH-Gradienten 406 A.3 SDS-Elektrophorese 413 A.3.1 Horizontale SDS PAGE 413 A.3.2 Vertikale PAGE 422 A.4 Zweidimensional-Elektrophorese 425 A.5 Semidry-Blotting 433 A.6 PAGE von DNA-Fragmenten 440 Literatur 443 Stichwortverzeichnis 445

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