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Contents

Weitere interessante Titel zur HPLC

V. R. Meyer

Fallstricke und Fehlerquellen der HPLC in Bildern

2006

ISBN 3-527-31268-4

V. R. Meyer

Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie

2004

ISBN 3-527-30726-5

S. Kromidas

More Practical Problem Solving in HPLC

2004

ISBN 3-527-31113-0

J. Weiß

Ionenchromatographie

2001

ISBN 3-527-28702-7

S. Kromidas

Practical Problem Solving in HPLC

2000

ISBN 3-527-29842-8

img

Herausgeber

Dr. Stavros Kromidas

Rosenstraße 16

66125 Saarbrücken

Vorwort

Das Optimieren von Verhaltensweisen und Prozessen stellt eine notwendige Voraussetzung für langfristigen Erfolg dar. Das Ziel und die Beweggründe können dabei recht unterschiedlich sein: Selbsterhaltung bei Lebewesen, „Leben retten“ beim Helfer in Afrika, Gewinnmaximierung beim Marketing-Strategen oder neue Erkenntnisse beim Wissenschaftler. Dieses Prinzip gilt natürlich auch in der Chemie und in der Analytik.

Das vorliegende Buch behandelt ausschließlich das Thema „Optimierung“ in der HPLC. Es wird versucht, diesen wichtigen Aspekt der HPLC auf vielfältige Art und Weise zu beleuchten. Zum einen haben wir uns mit grundsätzlichen Fragen und mit prinzipiellen Überlegungen und Hintergründen auseinander gesetzt. Im gleichen Maße haben wir uns bemüht, möglichst viele Praxisbeispiele, Anregungen und Vorschläge für den HPLC-Alltag vorzustellen und zu diskutieren. Die Ausführungen sollen beim Planen effektiver Strategien zur Methodenentwicklung ebenso unterstützen und helfen wie in der täglichen Praxis vor Ort, wenn es um Konzepte für eine schnelle Optimierung geht. Das Ziel des Buches ist, einen Beitrag für eine zweckgerichtete, bezahlbare Vorgehensweise bei Methodenentwicklung und Optimierung in der HPLC zu leisten.

Dazu haben international renommierte Fachleute ihr Wissen und ihre Erfahrungen zur Verfügung gestellt. Diesen Kollegen gilt mein herzlicher Dank. Dem Verlag WILEY-VCH und insbesondere Steffen Pauly danke ich für die sehr gute Zusammenarbeit und Kooperationsbereitschaft.

Saarbrücken, Januar 2006

Stavros Kromidas

Autorenverzeichnis

Klaus Albert

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Bonnie A. Alden

Waters Corporation, CRD

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Mario Arangio

CarboGen AG

Schachenallee 29

5001 Aarau

Schweiz

Wolf-Dieter Beinert

VWR International GmbH

Scientific Instruments

Hilpertstraße 20A

64295 Darmstadt

Roberto Biancardi

Solvay Solexis SpA

Viale Lombardia, 20

20021 Bollate (MI)

Italien

Hans Bilke

Sandoz GmbH

Biochemiestraße 10

6250 Kundl

Österreich

Yung-Fong Cheng

Cubist Pharmaceuticals

65 Hayden Ave.

Lexington, MA 02421

USA

Maristella Colombo

Oncology – Analytical Chemistry

Nerviano Medical Sciences

Viale le Pasteur, 10

20014 Nerviano (MI)

Italien

Diane M. Diehl

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

John W. Dolan

BASi Northwest Laboratory

3138 NE Rivergate

Building 301C

McMinnville, OR 97128

USA

Melvin R. Euerby

AstraZeneca R&D Charnwood

Analytical Development,

Pharmaceutical and Analytical R&D

Charnwood/Lund

Bakewell Road

Loughborough, Leicestershire,

LE11 5RH

United Kingdom

Sergey Galushko

Dr. S. Galushko Software

Entwicklung

Im Wiesengrund 49b

64367 Mühltal

Eric S. Grumbach

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Marc D. Grynbaum

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Heidi Händel

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Tom Hennessy

Biopolis

Biomedical Science Group

20 Biopolis way

Singapore 1 38668

Singapur

Pamela C. Iraneta

Waters Corporation, CRD

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Markus Juza

Chiral Technologies Europe

Parc d’Innovation

Boulevard Gonthier d’Andernach

BP 80140

67404 Illkirch Cedex

Frankreich

Marianna Kele

Waters Corporation, CRD

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Peter Kilz

PSS Polymer Standards Service

GmbH

Postfach 3368

55023 Mainz

Stavros Kromidas

Rosenstraße 16

66125 Saarbrücken

Manfred Krucker

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Hans-Joachim Kuss

Psychiatrische Klinik der

Ludwig-Maximilians-Universität

Nussbaumstraße 7

80336 München

Jörg P. Kutter

MIC – Department of Micro and

Nanotechnology

Technical University of Denmark

2800 Lyngby

Dänemark

Christiane Lohaus

Medizinisches Proteom-Center

Zentrum für Klinische Forschung

Ruhr-Universität Bochum

Universitätsstraße 150

44780 Bochum

Ziling Lu

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Egidijus Machtejevas

Institut für Anorganische Chemie

und Analytische Chemie

Johannes Gutenberg-Universität

Duesbergweg 10–14

55099 Mainz

Jürgen Maier-Rosenkranz

GRACE Davison –

Alltech Grom GmbH

Discovery Sciences

Etzwiesenstraße 37

72108 Rottenburg-Hailfingen

Friedrich Mandel

Agilent Technologies

Hewlett-Packard-Straße 8

76337 Waldbronn

Katia Marcucci

Sienabiotech S.p.A.

Via Fiorentina, 1

53100 Siena

Italien

Katrin Marcus

Medizinisches Proteom-Center

Zentrum für Klinische Forschung

Ruhr-Universität Bochum

Universitätsstraße 150

44780 Bochum

Jeffrey R. Mazzeo

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Michael McBrien

Advanced Chemistry Development, Inc.

110 Yonge Street, 14th Floor

Toronto, Ontario

Canada M5C 1T4

Alberto Méndez

Waters Cromatografia S.A.

Parc Tecnològic del Vallès

08290 Cerdanyola del Vallès

Barcelona

Spanien

Helmut E. Meyer

Medizinisches Proteom-Center

Zentrum für Klinische Forschung

Ruhr-Universität Bochum

Universitätsstraße 150

44780 Bochum

Veronika R. Meyer

EMPA St. Gallen

Materials Science and Technology

Lerchenfeldstraße 5

9014 St. Gallen

Schweiz

Egbert Müller

Tosoh Bioscience GmbH

Zettachring 6

70567 Stuttgart

Uwe D. Neue

Waters Corporation, CRD

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Patrik Petersson

AstraZeneca R&D Lund

Analytical Development

Pharmaceutical and Analytical R&D

Charnwood/Lund

Lund 22187

Schweden

Michael Pfeffer

Schering AG

In-Process-Control

13342 Berlin

Karsten Putzbach

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Oleg Pylypchenko

Institute of Bioorganic Chemistry of

Ukrainian National Academy of

Sciences

Murmanskaja str., 1

02660 Kiev-94, MCP-600

Ukraine

Milena Quaglia

LGC

Analytical Technology

Queens Road

Teddington, Middlesex, TW11 OLY

United Kingdom

Giuseppe Razzano

Via D. Manin,18

Magenta (Cap. 20013)

Milano

Italien

Vincenzo Rizzo

CISI – University of Milan

Via Fantoli, 16/15

20138 Milano

Italien

Heike Schäfer

Medizinisches Proteom-Center

Zentrum für Klinische Forschung

Ruhr-Universität Bochum

Universitätsstraße 150

44780 Bochum

Stefan Schömer

pro-isomehr

Altenkesseler Straße 17

66115 Saarbrücken

Irina Shishkina

Institute of Bioorganic Chemistry of

Ukrainian National Academy of

Sciences

Murmanskaja str., 1

02660 Kiev-94, MCP-600

Ukraine

Dirk Sievers

Waters GmbH

Hauptstraße 87

65760 Eschborn

Federico R. Sirtori

Nerviano Medical Sciences

Oncology – Analytical Chemistry

Viale Pasteur 10

20014 Nerviano (MI)

Italien

Urban Skogsberg

Cambrex Karlskoga AB

R&D Analysis

69185 Karlskoga

Schweden

Lloyd R. Snyder

LC Resources Inc.

26 Silverwood Ct.

Orinda, CA 94563

USA

Frank Steiner

Dionex Softron GmbH

Dornierstraße 4

82110 Germering

Cinzia Stella

Imperial College

Biological Chemistry Department

Biomedical Sciences Division

Sir Alexander Fleming Building

London, SW7 2AZ

United Kingdom

Vsevolod Tanchuk

Institute of Bioorganic Chemistry of

Ukrainian National Academy of

Sciences

Murmanskaja str., 1

02660 Kiev-94, MCP-600

Ukraine

KimVan Tran

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Klaus K. Unger

Institut für Anorganische Chemie

und Analytische Chemie

Johannes Gutenberg-Universität

Duesbergweg 10–14

55099 Mainz

Jean-Luc Veuthey

Faculty of Sciences

School of Pharmaceutical Sciences

University of Geneva

20, Bd d’Yvoy

1211 Genève 4

Schweiz

Knut Wagner

Pharma Analytical Laboratory

Merck KGaA

Frankfurter Straße 250

64293 Darmstadt

Michael G. Weller

Institut für Wasserchemie und

Chemische Balneologie

Technische Universität München

Marchioninistraße 17

81377 München

Norbert Welsch

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Loren Wrisley

Analytical and Quality Sciences

Wyeth Research

401 N. Middletown Road

Pearl River, NY 10965

USA

Zum Aufbau des Buches

Das Buch besteht aus fünf Teilen.

Teil 1: Grundsätzliches zur Optimierung in der HPLC

Im Teil 1 wird versucht, wichtige Aspekte der Optimierung in der HPLC aus verschiedenen Blickwinkeln zu beleuchten. Im ersten Kapitel (1.1 Stavros Kromidas) werden die Grundsätze der Optimierung am Beispiel der RP-HPLC dargestellt und Vorschläge zur Methodenentwicklung gemacht. Schnelle Gradienten an kurzen Säulen führen häufiger als man zunächst annehmen würde zu ausreichender Auflösung bei kürzesten Analysenzeiten, diese Thematik wird in Kapitel 1.2 diskutiert (Uwe D. Neue). Der pH-Wert ist bei der Trennung von polaren/ionischen Substanzen mit Abstand der wichtigste Faktor im Optimierungsgeschehen. Diesem Aspekt sind die zwei nachfolgenden Kapitel gewidmet (1.3 Uwe D. Neue, 1.4 Michael McBrien). Optimierung bedeutet mehr als lediglich die „richtige“ Wahl von Methodenparametern. Zur Optimierung gehören alle Bemühungen, möglichst die maximale – oder vielleicht die notwendige – Information zu gewinnen. So kommen der Auswertung von chromatographischen Daten und der Kalibrierung eine gewichtige Bedeutung zu. Diese Themen werden in Kapitel 1.5 (Hans-Joachim Kuss) und 1.6 (Stefan Schömer) behandelt.

Teil 2: Die Charakteristika der Optimierung in einzelnen HPLC-Modi

Im Teil 2 wird auf die Spezifika der Optimierung in einzelnen Techniken eingegangen. In der RP-Chromatographie (Abschnitt 2.1) stellt neben der Auswahl des Eluenten (s. dazu auch Kapitel 1.1 bis 1.4) vor allem die Säulenauswahl eine schwierige und zeitraubende Aufgabe dar. Das Thema „RP-Säule“ wird von insgesamt sechs Autoren bearbeitet: Zwei Autoren (2.1.1 Stavros Kromidas, 2.1.2 Uwe D. Neue) gehen eher praktisch an diese Aufgabenstellung heran, während Frank Steiner (2.1.5) und Lloyd R. Snyder (2.1.6) zur Frage „Säulencharakterisierung“ und „Säulenauswahl“ grundsätzliche, theoretische Überlegungen – jedoch mit konkreter, praktischer Relevanz – vorstellen. Mit der Anzahl von experimentellen Daten nimmt naturgemäß die Aussagekraft zu, wobei das Handling der Zahlen und vor allem das Finden und Deuten von Korrelationen nur mit mathematischen Tools möglich ist. Chemometrie ist ein geeignetes Tool, um beispielsweise die Ähnlichkeit von Säulen anhand chromatographischer Daten herauszufinden. Die Anwendung der Chemometrie aus praktischer Sicht wird kurz in Kapitel 2.1.1 (Stavros Kromidas) und ausführlich in Kapitel 2.1.3 (Melvin R. Euerby) und 2.1.4 (Cinzia Stella) dargestellt. Zum Abschluss des Abschnittes „RP-HPLC“ zeigt Urban Skogsberg (2.1.7), wie durch Magic-Angle-Spinning-NMR-Spektroskopie genaue Informationen über die Wechselwirkungen und die Anordnung von funktionellen Gruppen an RP-Oberflächen erhalten werden können. Anschließend geht es um die Optimierung, aber auch um die Fehlersuche und die Fehlervermeidung in folgenden Bereichen der HPLC: Normal Phase (2.2 Veronika R. Meyer), GPC (2.3 Peter Kilz), Gelfiltration (2.4 Klaus K. Unger), Affinitätschromatographie (2.5 Egbert Müller) und Enantiomerentrennung (2.6 Markus Juza). Drei unterschiedliche Ansätze wurden gewählt, um sich mit dem Thema Miniaturisierung auseinander zu setzen: Jürgen Maier-Rosenkranz beschäftigt sich in Kapitel 2.7.1 mit der Micro/Nano-LC, in Kapitel 2.7.2 stellt Jörg P. Kutter Flüssig(chromatographische)-Trennungen auf Chips vor und in Kapitel 2.7.3 beschreibt Uwe D. Neue die Möglichkeiten und Grenzen einer neuen Variante der klassischen HPLC, der UPLC. Mit allen drei Techniken ist eine bemerkenswerte Zeitersparnis möglich – es werden allerdings auch Limitierungen und Schwierigkeiten genannt.

Teil 3: Kopplungstechniken

Teil 3 ist ausschließlich den Kopplungen vorbehalten. Je anspruchsvoller die analytische Fragestellung in der Separationstechnik ist (Komplexität und Anzahl der Probenkomponenten, große chemische Ähnlichkeit der zu trennenden Analyte usw.), umso notwendiger erscheinen Kopplungstechniken. Dabei führen zum einen Kopplungen zwischen verschiedenen Trenntechniken zu einer Verbesserung der chromatographischen Auflösung wie z. B. Immunochromatographie (3.1 Michael G. Weller) und LC-GPC-Kopplung (3.2 Peter Kilz). Zum anderen führt bei einer gegebenen Auflösung die Kopplung LC-Spektroskopie zu einer spezifisch(er)en Aussage. Die populärsten Kopplungstechniken sind LC-MS (3.3 Friedrich Mandel) und LC-NMR (3.4 Klaus Albert).

Teil 4: Computer-unterstützte Optimierung

Automatisierung kann generell zur Fehlervermeidung und Zeitersparnis führen. Die vollautomatische bzw. halbautomatische, Computer-unterstützte Methodenentwicklung und Optimierung in der HPLC hat in der Zwischenzeit einen beachtlichen Reifegrad erreicht. Anhand mehrerer realer Beispiele legt Lloyd R. Snyder (4.1) die Möglichkeiten der DryLab- und Sergey Galushko (4.2) die der ChromSword-Software dar. Michael Pfeffer (4.3) vergleicht die zwei Software- Konzepte aus Anwendersicht und präsentiert ein neues Software-Tool, in dem auch die automatische Säulenauswahl integriert ist.

Teil 5: „Anwender berichten“

Im letzten Teil kommen Anwender zu Wort. In vier unterschiedlichen Fällen werden zwar anspruchsvolle und/oder neue Techniken/Konzepte zur Lösung einer bestimmten Fragestellung vorgestellt – diese jedoch eben aus Anwendersicht und praxisnah. Der eine oder andere Lösungsansatz könnte für manche(n)

Leser(in) eventuell interessant sein. Katrin Marcus (5.1) stellt die Praxis der LCMS/MS-Kopplung in der Proteomforschung vor, Hans Bilke (5.2) zeigt Wege zur Überprüfung der Robustheit in der RP-LC auf, Knut Wagner (5.3) beschreibt eine Hardware-Lösung zur Trennung komplexer Gemische und Mario Arangio (5.4) geht auf die Möglichkeit der Multidetektion (UV, MS, CLND) zur Charakterisierung neu synthetisierter Substanzen ein.

Die fünf Teile stellen thematische Einheiten dar, dennoch muss das Buch nicht unbedingt linear gelesen werden. Dazu wurden die einzelnen Kapitel so verfasst, dass sie abgeschlossene Module darstellen, ein „Springen“ ist jederzeit möglich. Damit haben wir versucht, dem Charakter des Buches als Nachschlagwerk gerecht zu werden. Unterschiedliche Auffassungen der Autoren zu einem Thema wurden akzeptiert, auch wurde manche Wiederholung in Kauf genommen, um die Harmonie im textlichen Kontext nicht zu beeinträchtigen. Schließlich werden einige wichtige Inhalte von mehreren Autoren behandelt, die naturgemäß unterschiedliche Akzente setzen. So beispielsweise „pH-Wert“ (Uwe D. Neue, Michael McBrien), „gewichtete Regression“ (Hans-Joachim Kuss, Stefan Schömer), „Selektivität von stationären RP-Phasen“ (Stavros Kromidas, Uwe D. Neue, Melvin R. Euerby, Cinzia Stella, Lloyd R. Snyder), „Chemometrie“ (Stavros Kromidas, Melvin R. Euerby, Cinzia Stella) oder „LC-MS“ (Friedrich Mandel, Katrin Marcus). Der Leser möge von der unterschiedlichen Darstellung des Themas und von der individuellen Gewichtung der Autoren profitieren.

1

Grundsätzliches zur Optimierung

1.1 Grundsätze der Optimierung in der HPLC am Beispiel der RP-Chromatographie

Stavros Kromidas

Zunächst werden einige Fragen diskutiert, die sinnvollerweise zu Beginn einer Methodenentwicklung zu klären sind. Anschließend wenden wir uns den prinzipiellen Möglichkeiten zur Verbesserung der Auflösung in der HPLC zu. Es folgt eine Diskussion über Effizienz und Abfolge der einzelnen Maßnahmen für den isokratischen und den Gradienten-Modus. Ein Schwerpunktthema der Ausführungen bilden Strategien und Konzepte zur Methodenentwicklung und Überprüfung der Peakhomogenität. Schließlich werden Wege zur Verfolgung weiterer Ziele als „besser trennen“ aufgezeigt: „schneller trennen“, „empfindlicher messen“, „Geld sparen“. Das Kapitel wird mit einer Zusammenfassung und einem Ausblick beendet.

1.1.1 Vor den ersten Optimierungsschritten

Es ist aus Gründen der Ökonomie sinnvoll, sich zu Beginn einer Methodenentwicklung/Trennungsoptimierung als erste Aktion mit folgenden Fragen zu befassen:

Auch wenn auf den ersten Blick diese Fragen etwas (zu) theoretisch oder gar abgehoben erscheinen mögen, halte ich es für notwendig, zu Beginn eines Projekts die analytische Fragestellung und die realistischen Möglichkeiten zu deren Bewältigung bewusst wahrzunehmen. Ein frühes Gespräch mit meinem Chef, meinem Kollegen, meinem Kunden oder zur Not mit mir selbst kann späteren Ärger, Zeitvergeudung und letztendlich Kosten ersparen. Diese Zeit kann als eine sichere Investition angesehen werden.

Zur ersten Frage: Was will ich?

Wenn irgend möglich, sollten vor dem Start folgende oder ähnliche Fragen beantwortet werden:

Es handelt sich, vereinfacht formuliert, um folgende Frage: Geht es im konkreten Fall um die Erfüllung von Anforderungen, oder geht es tatsächlich um „Wahrheit“, d. h., stehen formale Aspekte oder die analytische Fragestellung im Vordergrund? Diese Frage sollte wegen möglicher Konsequenzen bewusst und ehrlich beantwortet werden. Wie schwer es in unserer Zeit ist, zu sinnvollen und durchdachten Entscheidungen zu stehen, ohne als Exot oder gar als Querulant zu gelten, wurde an anderer Stelle beschrieben [1].

Wenn (!) das Umfeld es ermöglicht, sollte man sich darin üben, alles zu hinterfragen. Unkonventionelle Fragen führen häufig zu einfachen, vernünftigen Lösungswegen.

Zur zweiten Frage: Was habe ich?

Informationen über die Probe erleichtern die Entwicklung eines geeigneten Methodendesigns, z. B.:

Wenn die Widerstände nicht allzu groß sind, sollte man das Mittel der Kommunikation und des Austauschs nutzen – wenn es sein muss, ohne darüber zu sprechen.

Zur dritten Frage: Wie mache ich es?

Man sollte die Machbarkeit eines Vorhabens unbedingt realistisch abschätzen, mögen sonstige Fakten und Argumente objektiv auch noch so „richtig“ sein, z. B.:

Realitäten – und Meinungen sind auch Realitäten –, die über Erfolg und Misserfolg der analytischen Tätigkeit mitbestimmen, sollten, wenn irgend möglich, in das Methodendesign einfließen. So hilft es, wenn die Anzahl von Meetings zugunsten von „Kaffee-Runden“ und „Zusammen essen gehen“ herabgesetzt werden würde. Es gilt, die Kommunikation zu Lasten eines – in einer bestimmten Umgebung obligatorischen und erwarteten – „gekonnten“ Austauschs von Argumenten, „sich einbringen zu müssen“-Mentalität sowie der Darstellung von ohnehin bekannten Ansichten zu erhöhen.

Zusammenfassend wären für eine erfolgreiche Methodenentwicklung folgende zwei Grundvoraussetzungen zu nennen:

1. Fachliche Kompetenz ist vorhanden bzw. sie kann „ausgeliehen“ oder „eingekauft“ werden.
2. Die analytischen Möglichkeiten passen zu den Anforderungen, und man kann darüber sprechen.

Klares Definieren von Vorgaben, unmissverständlich formulierte, für alle Beteiligten nachvollziehbare Ziele, kurze Informationswege und kritisches Abschätzen von Möglichkeiten/Risiken sind meines Erachtens (nicht nur) in der Analytik wichtiger als das Erreichen von „Spitzen“-Werten, wie niedrige Nachweisgrenzen, Korrelationskoeffizienten um 0,999, VKs kleiner 1 % oder um 30 % günstigere Geräte.

1.1.2 Was heißt eigentlich „Optimierung“?

Bei den Bemühungen um Optimierung einer Trennung werden grundsätzlich folgende Ziele avisiert:

Die drei erstgenannten Ziele dürften die wichtigsten sein, und von diesen wiederum liegt die Verbesserung der Auflösung wahrscheinlich an erster Stelle. Wir werden uns daher zunächst und ausführlicher mit diesem Punkt beschäftigen, bevor wir uns den anderen Aspekten widmen. Die präparative HPLC ist nicht Gegenstand dieses Buches.

Vorbemerkungen

Die Theorie der Chromatographie gilt prinzipiell für alle chromatographischen Techniken. Demzufolge werden im Grundsatz stets die gleichen Optimierungsprinzipien verfolgt. Es liegt allerdings auf der Hand, dass die Prioritäten und die Gewichtung der einzelnen Maßnahmen beispielsweise in der GPC und in der μ-LC-MS(MS) doch recht unterschiedlich ausfallen. Nachfolgend werden Optimierungsmöglichkeiten aufgezeigt sowie in kompakter Form Vorschläge für die populärste der flüssigchromatographischen Techniken, der RP-HPLC, gemacht. Die Charakteristika in den anderen Modi werden in Kap. 2.1 bis 2.7 behandelt.

Die chromatographischen Regeln und die Theorie der HPLC werden als bekannt vorausgesetzt und hier nicht ausführlich behandelt; bei Bedarf werden einige Begriffe kurz wiederholt.

Nachfolgende Ausführungen gelten für isokratische Trennungen.

1.1.3 Verbesserung der Auflösung („besser trennen“)

Auflösung („resolution“, R) ist, vereinfacht ausgedrückt, der Abstand zweier benachbarter Peaks an der Peakbasis. Das ist also das, was jeder Praktiker bei der Verbesserung einer Trennung im Alltag im Visier hat, nämlich diesen Abstand zu vergrößern.

Die entsprechende Gleichung lautet:

img

N: Bodenzahl, sie ist ein Maß für die Trennleistung bzw. Säuleneffizienz. Die Bodenzahl ist letzten Endes ein Maß für die Verbreiterung der Substanzzone aufgrund von Diffusionsvorgängen. Hier geht es also um die Frage: Befinden sich die Analytmoleküle, die den Detektor erreichen, in einem kleinen oder in einem großen (Peak-)Volumen, d. h., erhalte ich schmale oder breite Peaks?

Genau genommen sollte man zwischen der theoretischen und der effektiven Bodenzahl unterscheiden. Die theoretische Bodenzahl ist die Bodenzahl einer inerten Komponente (s. unten) und damit eine charakteristische Größe, eine Konstante, für eine Säule bei definierten Bedingungen. Die effektive Bodenzahl ist die Bodenzahl einer bestimmten retardierten Komponente; in ihre Berechnung geht ihr Retentionsfaktor ein (s. unten). Heute wird allerdings dieser Unterschied nicht immer gemacht, die Rede ist lediglich von „der“ Bodenzahl. In den meisten Fällen wird die theoretische Bodenzahl berechnet – allerdings von retardierten Substanzen. In diesem Zusammenhang sollte man sich im Klaren darüber sein, dass die Bodenzahl von vielen Faktoren abhängig ist. Dies sind z. B. Injektionsvolumen, Temperatur, Eluentenzusammensetzung, Fluss, Retentionszeit, Analyt und nicht zuletzt die Berechnungsformel: Peakbreite an der Peakbasis, bei 10 % oder bei 50 % Peakhöhe? Daher kann ein Vergleich von Bodenzahlen aus der Literatur problematisch sein.

α: Trennfaktor, früher: Selektivitätsfaktor. α ist ein Maß für die Trennfähigkeit eines chromatographischen Systems für zwei bestimmte Komponenten. (Chromatographisches System: die aktuelle Kombination aus stationärer Phase, mobiler Phase, Temperatur.) Der α-Wert ist der Quotient aus den zwei Netto-Retentionszeiten, also der Quotient der Aufenthaltszeit der zwei Komponenten an der stationären Phase. Es geht hier um die Frage: Ist dieses chromatographische System in der Lage, zwei bestimmte Substanzen zu unterscheiden? Das heißt, ist es selektiv für diese zwei Substanzen, kann ich sie prinzipiell trennen? Selektivität ist, vereinfacht ausgedrückt, der Abstand zwischen zwei Peaks von Peakspitze zu Peakspitze. Der Unterschied zur Auflösung besteht darin, dass bei der Selektivität die Peakform (also die Bodenzahl) nicht berücksichtigt wird. Denke: α ist lediglich der Quotient aus zwei (Retentions-)Zeiten. Der Trennfaktor ist nur von der „Chemie“ abhängig (s. unten: Retentionsfaktor).

k: Retentionsfaktor, früher: Kapazitätsfaktor k'. k ist ein Maß für die Stärke der Wechselwirkung einer gegebenen Substanz in einem gegebenen chromatographischen System (chromatographisches System, s. oben.) Das heißt, um wie viel länger bleibt meine Substanz bei diesen Bedingungen an der stationären Phase im Vergleich zu der mobilen Phase? Der k-Wert ist ein Index (genauso wie der α-Wert) und unabhängig von apparativen Gegebenheiten wie Säulendimensionen und Fluss. Der k-Wert ändert sich nur, wenn Parameter verändert werden, die etwas mit Wechselwirkung zu tun haben, also mit der „Chemie“: stationäre Phase, mobile Phase, Temperatur. Solange diese Parameter konstant bleiben, bleibt der k-Wert konstant, unabhängig z. B. davon, wie hoch der Fluss ist und ob ich eine 10 oder eine 15 cm Säule verwende.

Obschon die Totzeit in der Formel für die Auflösung nicht explizit auftaucht, ist diese Kenngröße für die folgenden Ausführungen hilfreich. Daher sei kurz auch auf diesen Begriff eingegangen.

tm oder t0: Totzeit, Lösungsmittelpeak, Durchbruchszeit, Front, „Luftpeak“. Das ist die Aufenthaltszeit einer inerten Komponente in der HPLC-Anlage. Als inert wird eine Komponente bezeichnet, die sterisch ungehindert überall „hinkommt“, selbstverständlich auch in die Poren der stationären Phase, aber dort nicht festgehalten wird. Anders formuliert: Die Totzeit ist die Aufenthaltszeit einer jeden nicht ausgeschlossenen Komponenten in der mobilen Phase, auch in der stehenden mobilen Phase (d. h. innerhalb der Poren). Aber noch einmal: Es findet „keine“ Wechselwirkung mit der stationären Phase statt. Die Totzeit ändert sich demnach nur, wenn etwas „Physikalisches“, „Mechanisches“ passiert, z. B. Änderung der Länge/des Innendurchmessers der Säule, der Packungsdichte (Menge an stationärer Phase in der Säule) oder des Flusses. Die Totzeit, also die Aufenthaltszeit einer nicht ausgeschlossenen Komponente in der mobilen Phase, ist eine stoffunspezifische Zeit: Alle Komponenten wandern im Eluenten gleich schnell, die Aufenthaltszeit der Komponenten im Eluenten stellt keinen Beitrag zur Trennung dar. Eine Trennung ist nur möglich, wenn sich die Substanzen unterschiedlich lang an/in der stationären Phase aufhalten.

Die Auflösung R, der Abstand von Peakbasis zu Peakbasis, hängt ausschließlich von folgenden drei Faktoren ab:

Die Konsequenz lautet: Wenn ich die Auflösung verbessern möchte, stehen mir prinzipiell nur (?!) folgende drei Möglichkeiten zur Verfügung:

1.1.3.1 Prinzipielle Möglichkeiten zur Verbesserung der Auflösung

Das oben Geschilderte soll auf ein fiktives Beispiel angewandt werden (). Gehen wir von einer aktuell mangelnden Auflösung aus (, oberes Chromatogramm): Welche prinzipiellen Möglichkeiten haben wir, die Auflösung zu verbessern?

Bemerkung: Die Totzeit ändert sich nur bei Möglichkeit 1 („tm“↑).

Möglichkeit 1: Ich sorge dafür, dass alle Komponenten, einschließlich einer inerten Komponente (s. oben: Zunahme der Totzeit), später eluieren. Da nun auch die Totzeit zunimmt, kann hier nur etwas „Physikalisches“ vorgelegen haben: längere Säule, größerer Innendurchmesser (in der Praxis: breitere Peaks, also unbrauchbar), Verringerung der Flussrate.

Prinzipielle Möglichkeiten zur Verbesserung der Auflösung in der HPLC. Erläuterungen siehe Text.

img

Möglichkeit 2: Die Retentionszeit bleibt im Wesentlichen konstant, ich sorge lediglich für eine bessere Peakform. Hier gibt es etwas mehr Möglichkeiten: Verringerung des Totvolumens (z. B. dünnere Kapillaren, kleinere Detektorzelle), Verringerung des Injektionsvolumens (merke: eine lokale Überladung der Säule und damit Peakverbreiterung kommt häufiger vor, als man denkt: Die Bandenverbreiterung, verursacht durch die Injektion, verhält sich direkt proportional zum Injektionsvolumen.), bei Mischungen gleicher Elutionskraft Methanol gegen Acetonitril (ACN) austauschen – wegen der geringeren Viskosität – (bedingt konstante Retentionszeit), kleinere Teilchen verwenden, neue, besser gepackte Säule einsetzen. In diesem Zusammenhang sollte man auch an eine Optimierung der Injektion denken, die ebenfalls zu einer Verbesserung der Peakform und damit zur Erhöhung der Bodenzahl führt: Das Probenlösungsmittel sollte schwächer sein als der Eluent. Dazu verwende man zum Auflösen der Proben z. B. etwas mehr Wasser im Vergleich zur Eluentenzusammensetzung. Dadurch kann eine Aufkonzentrierung der Substanzzone am Säulenkopf erreicht werden. Das Ergebnis ist eine bessere Peakform.

Schließlich denke man auch an diverse Einstellungen wie „sample rate“, „bunching factor“, „peak width“, Spaltbreite bei einem Dioden-Array-Detektor usw. Auch dadurch kann man die Peakform merklich verbessern, ohne eine Änderung von „echten“ Methodenparametern, wie Säule oder Eluent, vorgenommen zu haben.

Möglichkeit 3a: Zunahme der Wechselwirkung zwischen Probe und stationärer Phase. Hier gibt es ja „nur“ die bereits erwähnten drei „chemischen“ Möglichkeiten: Änderung des Eluenten (z. B. Erhöhung des Wasseranteils), Erniedrigung der Temperatur, Änderung der stationären Phase (z. B. eine hydrophobere Phase verwenden).

Die Wechselwirkungen nehmen bei beiden zu trennenden Komponenten im gleichen Maße zu, die Retentionszeit nimmt ebenfalls gleichmäßig zu.

Möglichkeit 3b: Vorgehensweise wie unter Möglichkeit 3a, aber hier ist es gelungen, dass die Änderung der Wechselwirkungen für beide Komponenten unterschiedlich stark ausfällt: Die eine Komponente reagiert stärker auf die Änderung als die andere, z. B. durch Änderung des pH-Wertes.

Andere Möglichkeiten gibt es prinzipiell nicht. Denn noch einmal: R = f (N,α,k). Das bedeutet Folgendes: Wenn wir alle in der HPLC-Welt versuchen, die Auflösung zu verbessern, machen wir nichts anderes, als bewusst oder intuitiv an diesen drei Faktoren, die die Auflösung beeinflussen können, zu „drehen“:

1. Es gelingt uns, die Wechselwirkungen der uns interessierenden Komponenten mit der stationären Phase per se zu erhöhen, also „alles“ eluiert später (Möglichkeit 3a, Zunahme von k, z. B. Anteil von Wasser im Eluenten erhöhen). Oder es gelingt uns, die Wechselwirkung der Komponenten mit der stationären Phase individuell zu verändern, d. h., eine Komponente reagiert auf diese Änderung mehr/stärker als die andere (Möglichkeit 3b, Zunahme von α, z. B. pH-Wert-Änderung bei polaren/ionischen Komponenten). Beides hat mit „Chemie“ zu tun: Änderung der Temperatur oder Änderung des Eluenten (dazu gehören selbstverständlich der pH-Wert und sonstige Additiva) oder Änderung der stationären Phase.
2. Wir erhöhen die Bodenzahl, entweder bei (theoretisch) konstanter Retentionszeit, Möglichkeit 2 oder bei einer gleichzeitigen Zunahme der Retentionszeit, Möglichkeit 1.

Andere Möglichkeiten gibt es prinzipiell nicht!

Bemerkung: Selbstverständlich ändert sich bei einer Änderung von α und/oder k gleichzeitig auch N.

Nachdem wir gesehen haben, wie die Auflösung prinzipiell verbessert werden kann, stellen sich nun folgende zwei Fragen:

1. Welche der drei Möglichkeiten „bringt“ das meiste?
2. In welcher Reihenfolge sollte ich bei Optimierungsversuchen diese Parameter verändern, d. h., welche Vorgehensweise ist ökonomisch?

1.1.3.2 Was „bringt“ das meiste?

Betrachten wir erneut die Gleichung für die Auflösung:

img

Wie man der Formel entnehmen kann, reagiert R auf eine Änderung von α am empfindlichsten.

Somit ist eine Veränderung der Selektivität die eleganteste, häufig allerdings auch die am schwierigsten zu realisierende Maßnahme zur Verbesserung der Auflösung. Betrachten wir zur besseren Veranschaulichung zwei Zahlenbeispiele:

1. Bei einem α-Wert von 1,01 für zwei benachbarte Peaks brauche ich für eine Basislinien-Trennung 160.000 Böden. Wäre es möglich, den α-Wert auf 1,05 zu erhöhen, bräuchte ich für die gleiche Trennung lediglich ca. 2000 Böden! Anders formuliert: Wenn es mir gelingt, die Selektivität auch nur minimal zu verbessern, brauche ich für eine gegebene Auflösung wenig Böden, d. h., ich kann mir leisten, den Fluss zu erhöhen oder eine kürzere Säule einzusetzen – und beides führt ja zu kürzeren Analysenzeiten: Die „paar“ Böden, die ich durch die Flusserhöhung bzw. durch die Verkürzung der Säulenlänge verliere, stören mich auf Grund der verbesserten Selektivität nicht.
2. An einer Säule mit 9000 Böden eluiere die zweite der zu trennenden Komponenten mit einem k-Wert von 2, der α-Wert sei 1,05. Die aus diesen Werten errechnete Auflösung beträgt 0,75:

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Die Forderung für diese Trennung laute: Auflösung, mindestens R = 1 oder größer.

Welche Möglichkeiten gibt es nun?

Gelingt es, bei ähnlich starker Wechselwirkung (also in etwa konstanter k-Wert) den α-Wert auf 1,10 zu erhöhen, ergibt sich eine um ca. Faktor 2 erhöhte Auflösung!

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In der Abfolge der effektivsten Maßnahmen zur Verbesserung der Auflösung steht hinter der Selektivität direkt die Effizienz. Die Erhöhung der Bodenzahl gelingt entweder entsprechend dem klassischen Ansatz durch Erhöhung der Säulenlänge – wobei bei einer Verdoppelung der Säulenlänge und damit Verdoppelung der Retentionszeit und der Bodenzahl die Auflösung nur um img , also um Faktor 1,4 erhöht wird – oder heute häufiger durch eine Abnahme der Korngröße bei konstanten Säulendimensionen und somit auch konstanter Retentionszeit.

Weitere Möglichkeiten zur Erhöhung der Bodenzahl, wie bessere Packungsqualität oder Verringerung des Totvolumens der Apparatur (s. oben), dürften allgemein geläufig sein und werden hier nur erwähnt. Ein Zahlenbeispiel zur Verbesserung der Auflösung über die Bodenzahl findet sich unten.

Die dritte, einfachste, jedoch ab einem k-Wert von ca. 4 recht uneffektive Maßnahme ist die Erhöhung des k-Wertes. Auch dies soll anhand unseres Zahlenbeispiels demonstriert werden. Man könnte mit dem Ziel einer besseren Auflösung die Wechselwirkung erhöhen, zuerst vom ursprünglichen k-Wert von 2 auf einen k-Wert von 4, dann auf 6.

Die Auflösung verbessert sich dadurch auf 0,90 bzw. 0,97:

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Wir würden hier eine eher geringe Verbesserung der Auflösung bei einer allerdings merklichen Verlängerung der Analysenzeit erzielen (k-Wert von 6). Die Erhöhung der Wechselwirkung (z. B. Wasseranteil im Eluenten vergrößern) ist demnach eine im Alltag übliche, leicht zu realisierende, aber häufig recht uneffektive Maßnahme zur Verbesserung der Auflösung. Könnte ich jedoch bei einem k-Wert von 4 die Bodenzahl beispielsweise auf 15.000 erhöhen (kleinere Teilchen, Tricks beim Injizieren usw.), ließe sich die Auflösung immerhin auf 1,17 erhöhen:

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1.1.3.3 Welche Reihenfolge der Maßnahmen ist bei Optimierungsversuchen sinnvoll?

zeigt vereinfacht eine ökonomische Vorgehensweise, die im Folgenden erläutert wird.

Strategie einer Methodenentwicklung.

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Bemerkung: Steht eine Kopplungstechnik, z. B. LC/MS, zur Verfügung, so sollte diese Möglichkeit direkt zu Beginn oder wenigstens in einem sehr frühen Stadium genutzt werden (s. auch Abschnitt 1.1.4.3).

1. Frage: „Vernünftige“ Wechselwirkungen, akzeptable Analysendauer?

Nach einem ersten „Schuss“ bei einer unbekannten Probe oder bei Übernahme einer bestehenden Methode sollte vor jeglichen weiteren Optimierungsschritten die erste Frage lauten: Habe ich „vernünftige“ Wechselwirkungen? Die interessierenden Komponenten sollten bei isokratischen Trennungen im Bereich von ca. k = 2–8 eluieren, bei Gradiententrennungen mit einem img von ca. 5 für die Mitte des Chromatogramms (s. Abschnitt 1.1.3.4.2). Diese Bereiche stellen einen guten Kompromiss zwischen Analysendauer, Robustheit und Auflösung dar. Sind die Wechselwirkungen in Ordnung (k-Wert überprüfen!), aber die Analysendauer inakzeptabel, sollte der Fluss erhöht oder alternativ eine kürzere Säule eingesetzt werden.

2. Frage: Kann ich jetzt schnell über optimierte Einstellungen Informationen über die Peakhomogenität erhalten?

Bin ich mit der Analysendauer vorerst zufrieden, aber nicht mit der Auflösung, sollte ich zunächst klären, ob ich für die aktuelle Trennung (z. B. frühe/späte, schmale/breite Peaks) die Einstellungen wie „sampling time/period“, „peak width“, aber auch Wellenlänge usw. optimal gewählt habe. Anschließend gilt bei Bedarf meine Aufmerksamkeit dem effektivsten der drei Parameter, der Selektivität.

3. Frage: Ist die Selektivität ausreichend?

Habe ich nun eine kurze Analysenzeit und mit einem vertretbaren Aufwand eine zufrieden stellende Selektivität erreicht (Trennfaktor des kritischen Paares ca. 1,05–1,1), bin jedoch mit der Auflösung immer noch nicht zufrieden, so sollte ich jetzt die Effizienz erhöhen, also einfach ausgedrückt, die Peakform verbessern.

4. Frage: Kann ich die Bodenzahl erhöhen oder muss ich mich tatsächlich weiterhin mit der Selektivität beschäftigen, um eine bessere Auflösung zu erzielen?

Die Peakform zu verbessern – gleichbedeutend mit Bodenzahl erhöhen – ist häufig ökonomischer, als weiterhin zu versuchen, die Selektivität zu verbessern (Wechsel der „Chemie“, also von Säule und Eluent), um die gewünschte Auflösung zu erzielen.

Zwei reale Beispiele, aus [1] entnommen, sollen die oben aufgeführten Aussagen veranschaulichen:

Beispiel 1

zeigt das Chromatogramm einer bestehenden, validierten Methode aus dem Pharmabereich.

Die Methodenparameter lauten: Linearer Gradient von 10 % auf 90 % Methanol, übliche C18-Phase, 5 μm, Säule 125 × 4 mm, Fluss 1 mL/min, Raumtemperatur, Injektion von 30 μL Probe in Tetrahydrofuran (THF)/Acetonitril (ACN) gelöst. Der große Peak an der Totzeit wird von Matrixbestandteilen hervorgerufen und stört weiter nicht. Diese Trennung, die nicht als optimal zu bezeichnen ist, sollte auf schnelle und einfache Weise optimiert werden.

Schnelle Optimierung einer bestehenden Methode; Erläuterungen siehe Text.

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1. Frage: Analysendauer OK?

Nein. Das Erste, was stört, ist in der Tat die lange Analysenzeit: 16 min für zwei Peaks bei einer Routinemethode ist heute kaum vertretbar. Zuerst wurde der Fluss auf 2,6 mL/min erhöht. Wie zu erwarten, ergab sich eine geringere Analysendauer – ohne dass die Auflösung schlechter wurde. Wir hatten den Gradienten so angepasst, dass sich das gleiche Gradientenvolumen ergab (, s. Kap. 1.2).

Die Retentionszeit von 10 min ist jedoch für zwei Peaks immer noch zu lang. Nachdem der Druck bei dem aktuellen Fluss von 2,6 mL/min ca. 345 bar betrug, wurden als Nächstes die Anfangsbedingungen beim Gradienten verändert: Es wurde nicht bei 10 %, sondern bei 40 % Methanol begonnen (s. ). Mit der Retentionszeit von 3–4 min für zwei Peaks konnte man nun zufrieden sein.

2. und 3. Frage: Einstellungen OK, Selektivität OK?

Ja, s. Abstand zwischen den Peakspitzen in (das ist vereinfacht die Selektivität). Die Auflösung ist jedoch immer noch nicht ausreichend. Obwohl die Selektivität offensichtlich nicht schlecht war, konnte die Auflösung aufgrund des Frontings nicht als zufrieden stellend bezeichnet werden.

4. Frage: Kann ich die Peakform verbessern und damit die Bodenzahl erhöhen?

Ja, wir haben hier etwas Einfaches getestet: Die Probenlösung wurde zweimal mit dem Eluenten verdünnt (40/60 MeOH/H2O) und die resultierenden 120 μL erneut injiziert. Mit dem Ergebnis konnte man nun zufrieden sein (s. ).

Merke: Es ist besser, 100 oder 150 μL eluentähnliche Probenlösung als 20 oder 30 μL Probenlösung in einem im Vergleich zum Eluenten stärkeren Probenlösungsmittel zu injizieren.

Fazit: Im besprochenen Fall wurde zuerst die Analysenzeit optimiert und anschließend – da die Selektivität augenscheinlich ausreichend war – eine gute Auflösung lediglich durch eine Verbesserung der Peakform (Erhöhung der Bodenzahl) erreicht.

Beispiel 2

zeigt die isokratische Trennung von Metaboliten trizyklischer Antidepressiva. In ist die Trennung an einer 5 μm Luna C18-Säule dargestellt. Das kritische Paar (Peak 2 und 3 bei ca. 5,8 min) wird gerade angetrennt, der α-Wert beträgt 1,05.

Die Auflösung ist nicht ausreichend, es besteht Handlungsbedarf.

Hier können wir die 1. Frage, nämlich ob die Analysendauer OK ist, mit einem „ja“ beantworten. Was die Selektivität betrifft, ist die Einschätzung zugegebenermaßen schwieriger.

Würde man hier direkt die Trennung durch Wechsel von Säule und/oder Eluent verbessern wollen (also via Selektivität, „Chemie“), wäre dies vermutlich keine sehr rasche Angelegenheit. In wird die Trennung unter völlig gleichen Bedingungen, allerdings an einer 3 μm-Säule dargestellt. Bei praktisch gleicher Selektivität (α-Wert = 1,04) wird nahezu eine Basislinien-Trennung erreicht. Das Einsetzen einer Säule mit einer geringeren Korngröße ist ein schneller und häufig auch ein ökonomischer Weg. Merke: Sogar bei einer erreichten Selektivität von „nur“ 1,05 sollte man zunächst an eine Verbesserung der Auflösung über die Effizienz (N) denken, statt sich weiterhin den doch aufwendigeren „chemischen“ Möglichkeiten zu widmen: Säule, Eluent, Temperatur.

Verbesserung der Auflösung über die Bodenzahl.

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Als vereinfachtes Fazit und als Extrakt aus Beispiel 1 und 2 kann Folgendes geschlussfolgert weren („kαN-Prinzip“):

1. Sorgen Sie aus Gründen der Ökonomie zunächst für „vernünftige“ Wechselwirkungen (k) und akzeptable Retentionszeiten (z. B. durch Veränderung der Eluentenzusammensetzung, Flusserhöhung).
2. Versuchen Sie anschließend, mit einem vertretbaren Aufwand eine möglichst gute Selektivität zu erreichen: Das wären α-Werte um ca. 1,05–1,10 (z. B. organisches Lösungsmittel ändern, Modifier zusetzen, pH-Wert verändern).
3. Sind Sie mit der Auflösung immer noch nicht zufrieden, verbessern Sie jetzt die Peakform (N). Dies kann zum einen durch „wissenschaftliche“ Maßnahmen erreicht werden, z. B. kleinere Teilchen, am effektivsten in folgender Kombination: Säulenlänge und Teilchengröße erniedrigen, Fluss und evtl. Temperatur erhöhen. Zum anderen sollte man auch an einfache, aber nicht minder Erfolg versprechende „Tricks“ denken, die ebenfalls zu einer besseren Peakform führen: kleineres Injektionsvolumen, optimiertes Probenlösungsmittel, dünne/kurze Kapillaren.

1.1.3.4 Wie ändere ich k, α und N?

1.1.3.4.1 Isokratischer Modus

Bevor wir uns mit den Strategien zur Methodenentwicklung bei unbekannten Proben und zur Überprüfung der Peakhomogenität beschäftigen, schauen wir uns an, welche konkreten Maßnahmen zur Verfügung stehen, um k, α und N zu verändern bzw. zu erhöhen (s. ).

Bemerkung: In der angegebenen Abfolge der einzelnen Maßnahmen in nimmt die Effektivität (Zeitfaktor und Wichtigkeit) in der Regel ab. Das heißt natürlich nicht, dass beispielsweise die stationäre Phase bzgl. Selektivität eine untergeordnete Rolle spielt! Keinesfalls. Nur sollte man die anderen, schnelleren Möglichkeiten testen, bevor eine völlig neue Säule – in der Praxis häufig auf „gut Glück“ – ausprobiert wird (s. auch unten).

Mögliche Maßnahmen zur Verbesserung der Auflösung.

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1.1.3.4.2 Gradientenmodus

Vorbemerkung

Werden bei einer Gradiententrennung nicht mehr als 8–10 Peaks erwartet und liegt keine „schwierige“ Matrix wie Fermenterbrühe, Urin, Creme, Pflanzenextrakt usw. vor, so sind 125 oder gar 100 mm lange Säulen in der Regel entschieden zu lang (s. [1] und Ausführungen in Kap. 1.2 und Kap. 2.7.3). Wir konnten tatsächlich in vielen Fällen an einer üblichen HPLC-Anlage problemlos 4–6 Peaks an einer 10 mm/2 mm/2 μm C18-Säule trennen.

Für Gradiententrennungen gilt folgende Formel:

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img = mittlerer k-Wert; der Analyt befindet sich in der Mitte der Säule (Längsrichtung)
tG = Gradientendauer [min]
F = Fluss [mL/min]
Vm = Säulenvolumen
Δ%B= Änderung von B während der Gradientelution
S= Steigung der %B/tG-Kurve; für kleine Moleküle kann für S ein Wert von ca. 5 angenommen werden.

Der img - und natürlich auch der α-Wert können wie folgt verändert werden: